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液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法による水環境試料中の
テトラサイクリン系抗生物質の定量
○内藤宏孝
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はじめに
テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 抗 生 物 質 （ TCs） は ， 人 や 動 物 に 使 用 さ れ て い る が ， 特 に 動 物 用 と
しての使用が多く，医薬品だけでなく飼料添加物としても用いられ ており，最も多く使用
さ れ て い る 抗 生 物 質 の １ つ で あ る ．TCs は ，畜 産 施 設 周 辺 の 土 壌 や 水 域 で 検 出 さ れ て お り ，
また，その耐性菌が環境中に存在することが確認されている．このため，生態系への直接
的 な 影 響 だ け で な く ， 耐 性 菌 の 拡 散 に よ る 二 次 的 な リ ス ク も 懸 念 さ れ る こ と か ら ， TCs の
詳細な残留状況の把握が求められている．
現 在 ，TCs の 分 析 は ，主 に 液 体 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー ／ タ ン デ ム 質 量 分 析 法（ LC/MS/MS）
が適用されており，その前処理法は，固相抽出法が一般的に用いられている．しかし，固
相 抽 出 に お い て TCs は ， そ の 性 質 上 ， 疎 水 性 相 互 作 用 の ほ か ， 水 素 結 合 や キ レ ー ト 結 合 ，
イオン交換等の様々な作用が働くため，十分な回収が得られず，分析上の課題となってい
る ． そ こ で ， 今 回 ， 試 料 へ の EDTA-2Na の 添 加 と 固 相 カ ー ト リ ッ ジ か ら の 溶 出 方 法 を 検 討
し た 結 果 ， 簡 便 な 前 処 理 方 法 で ， TCs の 効 率 的 で し か も 再 現 性 の あ る 回 収 が 実 現 さ れ ， 環
境 水 中 に 存 在 す る 10 ng/L レ ベ ル の TCs を ， 精 度 よ く 定 量 す る こ と が 可 能 と な っ た の で 報
告する．
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分析方法
表 1
今 回 対 象 と し た TCs は ，ク ロ ル テ ト ラ サ
測定条件
LC: SHIMADZU LC-20 Series
カラム:Ascentis Express C18 (2.1mmφ×150mm, 2.7μm)
移動相: A: 0.2%ギ酸／水, B: CH3CN
B: 10→60 % (0→9 min, gradient) - 60→90%(9→10min,gradient) 90 %(10→14 min)
流量: 0.2 mL/min　カラム温度: 40 ℃　注入量: 10 μL
MS: AB Sciex API3200
イオン化法
： ESI-Positive
ターボガス温度
： 700 ℃
イオンスプレー電圧
： 5.5 kV
CTC
TC
OTC
DC
iso-CTC
ﾓﾆﾀｰｲｵﾝ (m/z ) 479>444 445>410 461>426 445>428 479>462
DP (V)
31
36
31
41
41
CE (V)
27
23
25
23
25
イ ク リ ン (CTC) ， テ ト ラ サ イ ク リ ン (TC) ，
オ キ シ テ ト ラ サ イ ク リ ン (OTC) ， ド キ シ サ
イ ク リ ン (DC) 及 び イ ソ ク ロ ル テ ト ラ サ イ
ク リ ン (iso-CTC)の 5 物 質 で あ る ．
水質試料にエチレンジアミン四酢酸二
ナ ト リ ウ ム 塩 (EDTA-2Na） を 添 加 し ， 固 相
カ ー ト リ ッ ジ (Oasis HLB)に 通 水 し た 後 ，メ
タ ノ ー ル ／ 0.1%ギ 酸 水 溶 液 (1:1, v/v)で 通 水 方 向 と 逆 向 き か ら 溶 出 し ， LC/MS/MS に よ り 表
1 に示す測定条件で定量した．
水質試料
固相抽出
水 洗
脱 水
0.100 L
EDTA-2Na 0.1 g
Oasis HLB (225 mg)
10～20 mL/min
精製水
20 mL
3 min吸引
溶 出
バックフラッシュ
CH3OH/0.1%ギ酸水溶液
(1:1,v/v) 4 mL
定 容
LC/MS/MS-SRM
0.1%ギ酸水溶液
10 mL
ESI-Positive
図 1
分析フロー
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結果
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3.1
検量線及び装置検出下限
表 2
CTC, DC に つ い て は 0.20 ng/mL ～ 100
装 置 検 出 下 限 (IDL)
IDL
最終液量 試料量 IDL試料換算値
(mL)
(L)
(ng/mL)
(ng/L)
物質名
ng/mL， TC, OTC 及 び iso-CTC に つ い て は
0.10 ng/mL～ 100 ng/mL の 標 準 溶 液 の 各 10
CTC
0.052
10
0.100
5.2
μ L を LC/MS/MS に 注 入 し ，注 入 濃 度 と 得
TC
0.023
10
0.100
2.3
られたクロマトグラムのピーク面積から
OTC
0.020
10
0.100
2.0
DC
0.035
10
0.100
3.5
iso-CTC
0.026
10
0.100
2.6
検 量 線 を 作 成 し た ．そ の 結 果 ，ど の 検 量 線
も こ の 濃 度 範 囲 で は 良 好 な 直 線 性 (r 2 >
0.999)が 確 認 さ れ た ．ま た , 検 量 線 の 最 低 濃 度 の 標 準 溶 液 (CTC, DC 0.2 ng/mL，TC, OTC,
iso-CTC 0.1 ng/mL)を 繰 り 返 し 測 定 し (n=7), 得 ら れ た 測 定 値 の 標 準 偏 差 を 用 い て 装 置 検
出 下 限 値 （ IDL） を 算 出 し た と こ ろ ， 表 2 の と お り と な り ， ど の TCs も 良 好 な 再 現 性 で
高感度に定量することが可能であった．
3.2
添加回収試験結果及び検出下限値
河 川 水（ 朝 鮮 川 ），海 水（ 名 古 屋 港 ）に TCs を 添 加 し ，添 加 回 収 試 験 を 行 っ た と こ ろ ，
表 3 に 示 し た と お り ，添 加 回 収 率 は 85～ 105%で ，変 動 係 数 も 2.3～ 4.5%と な り ，再 現 性
は良好であり，実試料に対して十分に適用可能であることが確認された．
ま た ，海 水 試 料 を 用 い ，
「 化 学 物 質 環 境 実 態 調 査 実 施 の 手 引 き（ 平 成 20 年 度 版 ）」に 定
められた方法に従って検出下限値を算出したところ，表 3 に示したとおり，どの物質も
10 ng/L レ ベ ル の 微 量 分 析 が 可 能 で あ っ た ．
表 3
添加回収試験結果及び検出下限値
添加回収試験（n=5)
試料量
(L)
MDL1)
(ng/L)
CTC
0.100
6.2
16
< 6.2
20
99
4.5
< 6.2
20
94
3.6
TC
0.100
3.0
7.7
< 3.0
20
98
2.5
< 3.0
20
95
4.2
OTC
0.100
2.9
7.4
< 2.9
20
99
3.7
< 2.9
20
97
2.7
DC
0.100
4.2
11
< 4.2
20
87
2.3
< 4.2
20
85
3.1
iso-CTC
0.100
2.8
7.1
< 2.8
20
105
2.8
7.7
20
100
4.4
物質名
MQL2)
(ng/L)
海水
河川水
無添加
添加量(ng) 回収率(%) C.V.(%)
(ng/L)
無添加
添加量(ng) 回収率(%) C.V.(%)
(ng/L)
1)　MDL：測定方法の検出下限値
2)　MQL：測定方法の定量下限値
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まとめ
LC/MS/MS に よ る 環 境 水 中 の テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 抗 生 物 質 の 分 析 法 を 開 発 し た ．試 料 は ,
固 相 抽 出 を 前 処 理 と し LC/MS/MS に よ り 定 量 し た ．本 法 は 簡 便 な 前 処 理 操 作 で 環 境 水 中 に
残 留 す る テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 抗 生 物 質 を 10 ng/L レ ベ ル で 定 量 す る こ と が 可 能 で あ り ， 環
境モニタリング法として有用であると考えられた．
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