1. No category

自然免疫における炎症の転写後調節
メカニズム
竹内 理
京都大学ウイルス研究所
感染防御研究分野
Toll-like receptors and their ligands
Mycoplasmal Bacterial
Lipopeptide Lipopeptide
LPS
IL-1
Flagellin
MD-2
TLR1
TLR6
MyD88
TLR2
MyD88
TLR2
TLR5
TLR4
MyD88
MyD88
MyD88
TRIF
IL-1R
cytoplasm
dsRNA
TLR3
ssRNA
IRF-3/-7 NF-κB
TRIF
TLR7
Proinflammatory cytokines
Type I IFNs
MyD88
TLR9
CpG DNA
CpG
Endosome
Zc3h12aはTLR刺激により発現誘導されるRNA分解酵素である
Zc3h12a=Regulatory RNase (Regnase-1)
A
Nuclease領域 CCCH Zinc finger
C
Regnase-1 32P
蛋白質 +
もしくは IL-6 3ʼ-UTR
RNA
D141N
変異体
RNA精製
596 aa
*
D141
インキュベーション
B
Regnase-1のRNase領域構造モデル
(b)
1000
500
400
300
200
100
PAGE
Regnase-1 のRNase活性
Regnase-1 D141N
(-)
Regnase-1欠損マウスマクロファージはTLR刺激に対するIL-6及
びIL-12p40発現が上昇している
IL-6 (ng/ml)
TLRリガンド
15
腹腔マクロファージ
チオグリコレート
培養上清
野生型�
0�
1�
2�
10
RNA
IL-6, IL-12p40測定 野生型�
Regnase-1-/-�
Northernブロット
5
Regnase-1-/-�
4�
0�
1�
2�
4 (h)�
0
med
MALP2
TLR4 (LPS) 刺激
IL-6�
12
KC�
TNF�
IκBα�
RANTES�
IP-10�
β-actin�
Poly I:C
10
8
LPS
R848
CpG-DNA
IL-12p40 (ng/ml)
野生型�
Regnase-1-/-�
6
4
2
0
med
Poly I:C
LPS
MALP2
R848
CpG-DNA
様々なTLRリガンドでマクロファージを刺激
Regnase-1は自己免疫性炎症性疾患の発症を抑制するために必
須である. 脾臓
野生型�
腸間膜リンパ節
野生型�
Regnase-1-/-�
Regnase-1-/-�
肺
抗核抗体
(O.D.)
0.5
0.4
野生型�
Regnase-1-/-�
野生型�
0.3
0.2
0.1
0
鼠径リンパ節
Regnase-1-/-�
鼠径リンパ節
IL-1βやTLR刺激はRegnase-1のリン酸化、ユビキチン化、プロテ
オソームによる分解を引き起こす。
A
IL-1β
Lysates
λ-phosphatase
B
C
HeLa細胞
A
MG-132 treatment
-
λ-phosphatase -
IL-1β (10 ng/ml)
+
-
-
+
Anti-Regnase-1 immunoblot
IP with Regnase-1
Lysates
+
+
Anti-Ub immunoblot
Anti-Regnase-1 immunoblot
IL-1β
B
0
(kDa)�
Regnase-1
250�
C
0.1% DMSO N Regnase-1
β-actin
5 15 30 120 240 5 MG‐132 (1 uM) 15 30 120 240 (min)
IB: Ub
IP: Reg1150�
100�
75�
IB: Reg175�
IP: Reg1
5 15 30
(min)
IKKβがRegnase-1のS435及びS439をリン酸化する
a
リコンビナント
Regnase-1 もしくはRegnase-1
蛋白質
S435A/S439A変異体
32P
ATP
IKKβ
+
IκBα
IKKβ
+ - -
+ + -
S435A/S439A
S439A
Regnase-1 - -
WT
Regnase-1
Regnase-1
WT
Regnase-1にはDSGxxSモチーフが存在する
S435A
In vitro キナーゼアッセイ
- - - -
+ + + +
(kDa)�
75�
Regnase-1
IκBα
Mouse Regnase-1
596 aa RNase
CCCH Zf
DSGxxS
50�
75�
Regnase-1
IκBα
50�
Cytokine gene regulation by the control of Regnase-1 expression
IL-6
TLR
MyD88
IRAKs
TRAF6
TAB2/3
TAB1
TAK1
Ub (K63 type)
NEMO
IKKα
IKKβ
IKK
complex
degradation
degradation
Regnase-1 mRNA
Ub
IkBa
PP
Ub (K48)
PP
Regnase-1
IL-6 mRNA
NF-kB
IL-6 mRNA
Regnase-1 mRNA Nucleus
Regnase-1
NF-kB