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CHROMATOGRAPHY CONSUMABLES
Product Specifications
Thermo Scientific
pH グラジェントバッファー
チャージバリアントのシンプルな分析方法の開発
Thermo Scientific™ pHグラジェントバッファーは、タンパク
やモノクローナル抗体（MAb ）に含まれるチャージバリアント
の LCによる分析方法の開発や、
QA/QCへのメソッド移管の時
間短縮を実現します。
・バッファー成分の特長により、速くて再現性の良い pHグラ
ジェントが可能です。また、分析方法の開発もシンプルで簡単
です。
・普段使用している生体分子分析用の LCカラムやシステムで、
pHグラジェントバッファーを使用することができます。ま
た、塩によるグラジェント時のように、移動相の調製に時間が
かかりません。
・pHグラジェントを使用する方法は、ほとんどの MAbに適用
可能です。
はじめに
バ イ オ 医 薬 品が 一 般 的にな ってきたた
されてきました。 しかし、それぞれの
チ ャ ー ジ バ リ ア ン トに 合 った 塩 グ ラ
め、バイオ医薬品に携わる分析者は、より
ジェントが必要なため、更なる検討が必
速く、汎用で、堅牢性に優れた分析方法を
要でした。サーモフィッシャーサイエン
求めています。これらの要件を満たすた
ティフィックがご提供するpHグラジェン
め、スクリーニング、メソッド開発、QA/
ト バ ッ フ ァ ー と MAb 分 析 用 カ ラ ム の
QCへのメソッド移管といった開発から
キットは、陽イオン交換を利用した pHの
製造段階を通して、分析方法は単純であ
直線的グラジェントで、非常に再現性が
ることが求められます。リコンビナント
良 好です。この LCを 利 用した pHグ ラ
モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体（ re c o m b i n a n t
ジェントによるアプローチは、さまざま
monoclonal antibodies ）には、シアリル化
な MAb チャージバリアントに適用でき
（sialylation ）、脱アミド（deamidation ）、 るため、分析方法の開発や QA/QCへのメ
C末端リジンのトランケーション
ソッド移管の時間を短縮します。従来か
（C-terminal lysine truncation ）が 混 在し
らの塩グラジェントとは異なり、モノク
ています。モノクローナル抗体の精製や
ロ ー ナ ル 抗 体の pIを 予 測できるため、
製造においては、バリアント構造の特定
チャージバリアントの保持時間を予想で
や副生成物の安定性だけではなく、分析
きます。これにより、より狭い pH範囲で
による抗体のキャラクター化、不純物の
グラジェント分析を行い、高い分離を得
定量が重要です。これは、抗体医薬品の安
ることができます。
全性・効能を証明するもので、
U.S. FDA
や 他の 国 々の 規 制 当 局で 求められてい
ます。
従来から、塩グラジェントを利用した陽
イオンクロマトグラフィーにより、
MAb
のチャージバリアントがキャラクター化
pH グラジェントバッファーの濃度
60
は、
2つの濃度の緩衝液を使用します。これ
25
10.50
pH trace
の pH範囲では、両方のバッファーに含ま
れる 緩 衝 剤は 中 性もしくは マ イ ナ スに
チャージしています。よって、両方のバッ
ファーに含まれる緩衝剤は、
キットに含ま
れる陽イオン交換カラムには保持されず、
“good buffer ”として作用します。
シンプル
を0 %から100 %にプログラムするだけ
で、pH 5 .6から pH 10 .2のリニアーグラ
ジェントが可能です。
のカラムを使用しています。グラジェン
この結果より、
pHグラジェントはチャー
には、分析方法の最適化が必要になるこ
ジェントにするか、より狭い範囲で pHグ
ラジェントを行うことになります。勾配
の低い pHグラジェントを行えば、溶出順
序が変わらないのでクロマトグラムのプ
ロファイルが予想できます。図2は、ソフ
ト ウ ェ アを 使 用して、
pHグ ラ ジ ェ ン ト
バ ッ フ ァ ー を 狭 い pH 範 囲 で 行 っ た と
きの検討例です。移動相 Bを0 %から
100%にし、バッファー Bを pH 7.9にし、
次に移動相 Bを25 %から100 %にして分
析を行いました。
12.5
15.0
Retention Time (min)
17.5
5.00
20.0
10.50
pH trace
9.00
7.00
6.00
0
5
10
15
20
25
30
35
40
5.00
8.50
pH trace
(b)
20.0
7.00
10.0
6.00
-5.0
とがあります。より 勾 配の 低い pHグ ラ
10.0
10.0
回を超える分析を行っても0.8%でした。
チャージバリアントの分離を向上させる
7.5
8.00
は20分です。保持時間の %RSDは、300
0
16.0
5
10
15
20
25
30
35
5.00
8.00
pH trace
(c)
40
7.75
10.0
7.50
pH
シンプルな分析方法の最適化
5.0
20.0
0.0
性が良いといえます。
2.5
30.0
トは15分 間 行い、1回あたりの 分 析 時 間
ジバリアントの分離において非常に再現
5回注入
(a)
25.0
Absorbance (mAU)
この分析には Thermo Scientific
MAbPac™ SCX-10 、5 µm、4 x50 mm
6.00
40.0
再現性のよい pH グラジェント
A ）の pHグラジェントによる分析例です。
100回注入
図1：pHグラジェントバッファーを利用して得られた再現性
カラム：MAbPac SCX-10、5 µm、4 × 50 mm; サンプル：ribonuclease A
-5.0
図1は、
リボヌクレアーゼ A（ribonuclease
7.00
-50
-100
0.0
Absorbance (mAU)
方は簡単で、溶媒を10倍希釈するだけで
200回注入
-75
この pHグラジェントバッファーの使い
す。移動相 Aを100 %から0 %、移動相 B
8.00
-25
pH
5.6で、バッファー Bは pHが10.2です。こ
pH
が 含まれています。バッファー Aは pHが
9.00
300回注入
0
pH
らの緩衝液は特許取得済みで、
両性イオン
Absorbance (mAU)
pHグラジェントによる分析方法の構築に
Absorbance (mAU)
2
7.25
5.0
-2.0
7.00
0
5
10
15
20
25
30
35
Retention Time (min)
図2：pHグラジェントを利用した MAbチャージバリアントの分離検討
カラム：MAbPac SCX-10、10 µm、4 × 250 mm
（a ）0 % B（pH 5 .6）から100 % B（pH 10 .2）
（b ）0 % B（pH 5 .6）から 50 % B（pH 7 .9）
（c ）25 % B（pH 6 .75）から 50 % B（pH 7 .9）
6.60
40
チャージバリアントの pI 予測
10.5
pHグラジェント分析時に pHをモニター
10
すると、チャージバリアントの pIが予測
9.5
れぞれ固有の pIを超えると、溶出する性
質を持つためです。図3は、6つのタンパ
クを分析し、保持時間を基に pHを測定し
た結果です。これにより、理論による pI値
と測定による pHの相関関係が得られま
した。この分析の結果、保持時間より得ら
れた pHから、タンパクの pIが予測できま
した。
Cytochrome C
9
pH
（測定値）
できます。これは、タンパクや MAbがそ
3
y = 1.6923x - 7.2914
R2 = 0.9929
8.5
Ribonuclease A
8
Trypsinogen
7.5
7
6.5
6
5.5
7.5
Lectin-3
Lectin-2
Lectin-1
8.5
pI
（理論値）
9.5
10.5
図3：6つのタンパクの pI（理論値）に対する pH（測定値）
関連製品
pH デザイナーソフトウェア
Thermo Scientific pH デザイナーソフトウェアは、それぞれのチャージバリアントに
合った pHグラジェントを、より簡単にプログラムすることができます。このソフト
ウェアパッケージには、個々の pHグラジェントをどのようにプログラムするかが記
載されています。また、
pHグラジェントプロファイルによって分離できるだけではな
く、イオン強度や緩衝キャパシティ（buffering capacity ）が予測できます。
Thermo Scientific ProPac™ と MAbPac 陽イオン
交換カラム
ProPacと MAbPac陽イオン交換カラムは、タンパクやモノクローナル抗体、これに関
連するバリアントの高分離・高効率分析を目的に開発されたカラムです。このユニー
クな無多孔性の充塡剤は、バリアントの1電荷の違いを分離できるほど、分離に優れた
カラムです。MAbPacシリーズには3 µmや5 µmの充填剤もありますので、従来より
も高速かつ高分離が期待できます。
Thermo Scientific Dionex™ PCM-3000
pH グラジェントセパレーションモジュール
PCM-3000 pH グ ラ ジ ェ ン ト セ パ レ ー シ ョ ン モ ジ ュ ー ルは、Thermo Scientific
Dionex UltiMate™ 3000に接続することができ、pHグラジェントによるイオン交換
クロマトグラフィーを行う際には非常に便利です。モノクローナル抗体やチャージバ
リアントを分析する場合、伝導度でpHをモニターすることができます。pHグラジェン
トで pHの範囲を検討する場合や、pI値が分からない場合に便利です。
Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 BioRS システム
UltiMate 3000 BioRS システムは、生体分子の分析において、高速高分離が必要な場
合にも対応できる UHPLCシステムです。このシステムは生体分子の分析に適合する
ように、チタニウム製のポンプです。また、ステンレスを用いない特殊合金製の、流路
拡散の少ない配管類を使用しているため、高いピークキャパシティが得られます。ま
た、タンパク、ペプチド、バイオ医薬品といった複雑なサンプル分析時にも高感度が得
られます。Thermo Scientific Dionex Viper™フィンガータイトフィッティングは、堅
牢性に優れたフィッティングとデッドボリュームの無い接続を可能にし、高いパ
フォーマンスを実現します。UltiMate 3000 BioRS システムは、
ペプチドマッピング、
モノクローナル抗体のチャージバリアント、糖鎖、核酸といった生体分子分析のニー
ズにお応えできます。
pH測定値
pH
（測定値）
とpI
（理論値）
の相関性
オーダーインフォメーション
た、
125 mLのペアにカラムがセットになった商品もご用意しています。
・CX-1 pH Gradient Starter Kitは 次の 商 品を 含みます : 125 mLの バ ッ フ ァ ー Aおよび バ ッ フ ァ ー B、
MAbPac SCX-10、10 µm、4 x 250 mmカラム1本
・CX-1 pH Gradient High Throughput Kitは次の商品を含みます: 125 mLのバッファーAおよびバッファーB、
MAbPac SCX-10、5 µm、4 x 50 mmカラム1本
Product Specifications
Thermo Scientific pH バッファー濃縮液は、個々のバッファーをご購入いただくことも、バッファー Aと
バッファー Bのペアでご購入いただくことも可能です。容量は、
125 mLと250 mLをご用意しています。ま
・CX-1 pH Gradient High Resolution Kitは次の商品を含みます: 125 mLのバッファーAおよびバッファーB、
MAbPac SCX-10、5 µm、4 x 250 mmカラム1本
・製品番号083380、083376、083270は、各バッファー、カラム、
pH デザイナーソフトウェアも含みます。
オーダーインフォメーション
製品番号
詳細
083273
CX-1 pH Gradient Buffer A (pH 5 .6 ), 125 mL
083275
CX-1 pH Gradient Buffer B (pH 10 .2 ), 125 mL
083274
CX-1 pH Gradient Buffer Kit (pH 5 .6 to 10 .2 ), 125 mL
085346
CX-1 pH Gradient Buffer A (pH 5 .6 ), 250 mL
085348
CX-1 pH Gradient Buffer B (pH 10 .2 ), 250 mL
085349
CX-1 pH Gradient Buffer Kit (pH 5 .6 to 10 .2 ), 250 mL
083381
CX-1 pH Gradient Starter Kit (pH 5 .6 to 10 .2 ), 125 mL
083378
CX-1 pH Gradient High Throughput Kit (pH 5 .6 to 10 .2 ), 125 mL
083272
CX-1 pH Gradient High Resolution Kit (pH 5 .6 to 10 .2 ), 125 mL
083380
CX-1 pH Gradient Starter Platform (pH 5 .6 to 10 .2 ), 125 mL
083376
CX-1 pH Gradient High Throughput Platform (pH 5 .6 to 10 .2 ), 125 mL
083270
CX-1 pH Gradient High Resolution Platform (pH 5 .6 to 10 .2 ), 125 mL
085022
pH Designer Software
Ⓒ 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. 無断複写・転載を禁じます。
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サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
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〒221-0022 横浜市神奈川区守屋町3 -9
E-mail : [email protected]
www.thermoscientific.jp
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E1404