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富山大学
和漢医薬学総合研究所 教授 森田洋行
実 験
背 景 と 目 的
資源が枯渇しつつある現代にあって天然資源から新規生理
活性物質を見いだし創薬シードとして提供していくことが困難
になりつつある。そのため、従来の天然資源からの生理活性
物質の探索に変わるあらたな創薬シード化合物群の探索法
が求められている。一方、天然有機化合物の生合成に関与す
る二次代謝酵素の中には、酵素としては異例ともいえる曖昧
な基質特異性を有するものがあり、様々な骨格を有する新規
化合物を創出することが可能である。本研究では、植物ポリ
フェノールの基本骨格を構築するⅢ型ポリケタイド合成酵素
（PKS）に着目し、アロエ由来PKS、オクタケタイド合成酵素
（OKS）の活性中心キャビティ構成アミノ酸残基に欠損変異を
加えることにより、新規化合物の創出を目指した。
PCR 法を用いて変異を導入
↓
大腸菌を用いて変異酵素を発現
↓
超音波破砕にて蛋白質を抽出
↓
Ni-キレートアフィニティ−カラム
↓
陰イオン交換カラム
↓
酵素反応・結晶化
酵素反応
OKS変異酵素 20 µg
アシルCoA 25 nmol
マロニルCoA 50 nmol
0.1 M リン酸バッファー, pH 7.0
全量 500 ml
↓25 ˚C、16時間
↓20% HCL, 20 ml
↓酢酸エチルで生成物を抽出
LC-MS
実験結果
HO
従来研究との比較
nx
従来研究
Ⅲ型PKSの活性中心キャビティ構成アミノ酸残基の一部を他
のアミノ酸残基に置換することにより、活性中心キャビティの形
状と容積を変化させて新規ポリケタイドやアルカロイドを創出
8x
CoAS
OH
O
O
CoAS
O
O
OKS
N222G
O
O
O
O
SEK4
SEK4b
Y. 39%
O
O
Y50
不活性化
ΔV351
O
+
nx
HO
SEK4b
NH2
SCoA
O
O
O
H2N
SCoA
+
nx
HO
SCoA
O
O
O
6
O
x
HO
O
+
5
SEK4b
x
SEK4
280 nm
OKS ΔV351変異酵素
H316
H316
S352
N349
C174
V351
S352
N349
C174
(分解能 2.95 Å)
シッティングドロップ蒸気拡散法, 20 ˚C
0.2 M NH4HCO2, 20% PEG3350
まとめ・今後の展望
14 x
HO
OH OH O
OH
OH
HO
OH
OH O
280 nm
WT
ΔV351
280 nm 不活性化
ΔV351
OKS野生型
O
OH O
x
N218
COOH
10 x
5
ODS-80Ts, H2O/MeOH, 0.1% TFA, 0-5 min; 30% MeOH, 5-17 min; 30-60% MeOH, 17-25 min; 60% MeOH, O
H2N
本研究での取り組み
酵素の活性中心キャビティ構成アミノ酸残基の一部を欠損さ
せ、活性中心キャビティを従来とは全く異なった形状と容積に
変換することにより、新規化合物を創出。 8x
+
O
不活性化
ΔV351
G222
OH
Y50
O
HO
WT
ΔV351
O
O
G222
N218
HO
+
SEK4
S
O
nx
OH
O
SEK4b
SEK4
SCoA
O
O
O
O
I206/G207欠損型
HO
O
F50 (分解能 2.6 Å)
F50 (分解能 2.8 Å)
Abe et al., JACS, 127, 12709 (2005); Shi et al., OL, 11, 551 (2009); Wanibuchi et al., BMCL, 21, 2083 (2011)
OKS野生型
6
Cys174
O
O
+
O
SEK4b
HO
N218
N222
HO
x
O
O
WT
キダチアロエ �
Aloe arborescens
O
H2N
HO
OH
基質
入り口
O
OH
O
x
HO
O
OH
HO
8
OH O
O
N222
O
280 nm ΔV351
不活性化
ΔV351
Y. 14%
N346
O
O
O
O
S
O
HO
HO
x
O
O
OH
HO
OH
8
O
SEK15
C174
O
HO
x
OH
HO
SEnz
O
O
O
3
SCoA
Cys174
N218
OH
OH
HO
O
基質
入り口
O
O
O
H313
O
O
Y. 9.7%
OH O
OKS N222G
N346
O
O
OKS野生型
H313
C174
SEnz
SCoA
O
OH O
OH
O
WT
ΔV351
O
HO
O
O
KM = 55 µM, kcat = 2.7 x 10-3 min-1, kcat/KM = 4.9 x 10 min-1 M-1
O
O
O
O
HO
HO
HO
nx
+
O
O
OH
O
HO
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
O
KM = 95 µM, kcat = 9.4 x 10-2 min-1, kcat/KM = 9.0 x 102 min-1 M-1
10 x
O
SCoA
SCoA
SEK4
OH
OKS
WT
HO
OH O
O
HO
OH
HO
O
OH
O
OKSの351番目のアミノ酸を欠損させた変異酵素が、野生型と
は異なった活性を有する可能性が示された。骨格の異なる他
の基質を用いることにより、または、さらに追加の変異を導入す
ることにより、新規化合物の創出が期待される。
【地域社会や産業界での応用分野・活用方法 等】 本成果で得た変異酵素遺伝子は他の生合成酵素遺伝子とともに酵母などで再構築可能であることから、最終的には、醗酵工学
や合成生物学的手法による生理活性物質の供給に活用できるものと期待している。
連絡先
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