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日本実験動物学会（６０分）
「体内時計を基盤にした動物実験の実施について」
早稲田大学、理工学術院、柴田重信
（http://www.waseda.jp/sem-shibatas/）
[email protected]
体内時計の性質の違い（マウスとヒト）
夜行性と昼行性
主時計
光同調
ヒト
光刺激
視交叉上核
脳・末梢時計
脳内/末梢組織
睡眠・覚醒
体温
ホルモン
代謝
網膜
マウス
光刺激
網膜
同位相
逆位相
体内時計の周期
ヒト
２４時間より長く、２４．３時間
マウス
系統差
ラット
２４時間、あるいは少し長い、ICR, C57/BL
２４時間より短い、Bulb/c
２４時間より長い
ハムスター
２４時間より長い
飼育明暗環境が悪くなると、フリーランしてしまう。つまり時刻がずれていく。
光感受性、
マウス（夜行性）＞ヒト（昼行性）
マウス：１０ ＬｕｘでＯＫ
体内時計の仕組み
主時計
光同調
視交叉上核
非光刺激
繰り返しの
給餌刺激
メタンフェタミン
脳内/末梢組織
睡眠・覚醒
体温
ホルモン
代謝
網膜
光刺激
脳・末梢時計
DMH ?
VTA/ACC？
体内時計とは何か？
（１）ウルトラディアンリズム（９０分周期）：睡眠・覚醒
（２）サーカディアンリズム（２４時間周期）：一般的
（３）サーカルーナリズム（１月周期）：月経
（４）サーカアニュアルリズム（１年周期）：繁殖
体内時計は生体に周期変動をもたらす仕組みであり、周期が短いものから、長いものまで
ある。この中で、時計遺伝子が発見され、分子基盤がわかっているのはサーカディアンリズム
だけである。
新生児は夜生まれる
夜中の４時
ハエの羽化リズムと同じである
日内リズム、日周リズム
概日リズム、サーカディアンリズム
ラットの活動量のリズム。左側は１２時間の明期と１２時間の暗期に同調している。
右側は恒常的な暗期で飼育しているため、活動開始が遅れている。つまり２４時間より長い
周期のリズムが見られる。
体内時計の3要素
周期
位相
振幅
２４時間に近い周期を持つが、時計遺伝子が壊れると
長くなったり、短くなったりする。また、老化すると短めに
なる。
グリニッジを標準時間として、時刻を決めているように
体内時計も標準時間に対する時刻の進みや遅れを決める。
視交差上核を標準時間とすると、マウスの肺や
肝臓などにある時計の時刻は遅れていることが分かっている。
振動の大きさであり、体温の日内リズム変動の大きさは
小さいが、血中のメラトニン量や肝臓にある酵素では
数倍に変動するものもある。老化が進むと一般的に
振幅が小さくなる。
明暗環境： 光周性
マウス、ラットなど。 通常明暗環境（LD, 12:12）で飼育
季節性繁殖する動物： ハムスターなど。 長日明暗環境（LD, 14:10）で飼育
睾丸が大きくなる
短日
エネルギー代謝
が、変わる
長日
生きた状態で体内時計を計測する
ZT11
ZT15
ZT19
ZT23
ZT3
ZT7
In Vivo Imaging System(IVIS);生きたままリズム測定
腎臓
顎下腺
肝臓
14
Ｔａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ２０１２
正常、長日、短日下の末梢時計のリズムの位相変化
intact L期合わせ, 時間比合わせ, D期合わせ
Lights-off
↓ adjustment
50
0
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 0
luciferase activity(%)
luciferase activity(%)
100
↓ adjustment
200
200
150
Lights-on
Middle
150
100
50
0
0
6
12
18
24
30
36
↓ adjustment
200
luciferase activity(%)
Kidney
150
100
50
0
0
42
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
150
100
50
0
0
4
200
luciferase activity(%)
200
luciferase activity(%)
luciferase activity(%)
Liver
150
100
50
0
0
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 0
4
200
150
100
50
0
0
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
150
100
50
0
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 0
200
200
luciferase activity(%)
200
luciferase activity(%)
luciferase activity (%)
Salivary gland
150
100
50
0
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ chronobiology International, in press, 2014
150
100
50
0
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44
動物舎のタイマーが壊れた
マウスの行動は
恒常暗条件
安定したフリーラン
恒常明条件
長周期のフリーラン
その後、リズム消失
明暗
恒常明
LD 肝臓
LL 肝臓
240
240
200
200
160
160
120
120
80
80
40
40
0
15
20
25
30
35
0
4515
40
20
LD 顎下腺
25
30
35
40
45
LL 顎下腺
240
240
200
200
160
160
120
120
80
80
40
40
0
0
15
20
25
30
35
40
45
15
20
25
30
35
40
45
体内時計の同調刺激
ほぼ２４時間周期で入ってくる外来性の刺激で、その刺激に位相が合う
（１）光
（２）温度
（３）食餌 （餌、水、食塩）
（５）ストレス
（１） 光
光照射のタイミング
光の強度
（10 Lux）
光の波長（青色光に強く反応）
夜間は暗い赤色光で作業する
上の図は睡眠の模式図であり、
暗闇の中では、入眠のタイミング
（起床時） が毎日後ろにずれていく。起床時
（赤丸）に光照射をすると、次の日
（入眠時） の入眠時刻が、早まる（前進）。一
方、入眠してすぐに（青丸）光照射
すると、次の日の入眠時刻が遅く
なる（後退）。
ところで、寝ていないとき（黄丸）に
光照射しても、ずれない。
起床
入眠
下図は、入眠するときを１２時と定
義し結果をプロットすると、図のよ
うな曲線が得られる。すなわち夜
の前半に強い光を浴びると時計
が遅れるようになり、朝起きるの
がますますつらくなります。
起床して朝日を浴びると時計が前
に進み遅れなくてすみます。
LD condition
Period：27.3hr
(=24×8/7)
Activity rhythm
Free-running
period ：25.2 hr
体内時計を合わせられない。
Alignment and Misalignment
正常明暗
240
200
160
120
80
40
0
腎臓
肝臓
顎下腺
17:00 21:00 1:00
位相後退
9:00 13:00
240
200
160
120
80
40
0
腎臓
肝臓
顎下腺
17:00 21:00 1:00
恒常明
5:00
240
200
160
120
80
40
0
[実時間] 17:00 21:00
5:00
9:00 13:00
腎臓
肝臓
顎下腺
1:00
5:00
9:00
13:00
末梢臓器の時計の振幅を低下させる。
24時間社会と化している現代において、睡眠に問題を抱えている人は非常に多い。
※約4割の人が「朝起きても熟睡感がない」などと回答している。
(H12 健康福祉動向調査)
このような睡眠の質に関与する原因の一つとして睡眠・覚醒リズムの乱れが
考えられる。
■睡眠・覚醒リズムの乱れ
RGBの発光ダイオードによるバックライト
輝度・スペクトル調整が可能なテレビ
メラトニン(睡眠)
コルチゾール(覚醒)
テレビの
光刺激
夜遅いテレビの視聴は：
分泌抑制
↓↓
不眠
分泌促進
↑↑
（１）メラトニン分泌不足、不眠。
（２）覚醒状態をもたらす、不眠。
（３）体内時計を遅らせる。
実験装置
0.1
Normal
放射輝度(W/(sr･m・m))
放射輝度(W/(sr･m・m))
0.1
(b)通常輝度 ４５０ｃｄ
２３０ｃｄ
1/2Blue light
0.08
0.06
0.04
0.02
0
400
500
600
700
(c)高輝度 １２００ｃｄ
0.1
Normal
放射輝度(W/(sr･m・m))
(a)低輝度
1/2Blue light
0.08
0.06
0.04
0.02
0
400
波長(nm)
500
600
700
Normal
1/2Blue light
0.08
0.06
0.04
0.02
0
400
波長(nm)
Fig.3
500
600
波長(nm)
本研究で用いたテレビのスペクトル分布
(a)Normal
ビデオ：「釣りバカ日誌、#15、 #17」
(b)1/2Blue light
上映時間、赤、緑、青の平均輝度割合が同じ
700
各輝度条件のテレビの視聴によるメラトニンへの影響
※
8
睡眠
メラトニン濃度変化(pg/ml)
覚醒
※
6
*
4
*
2
0
-2
-4
-6
Dark
(12)
Fig.6
Normal 1/2Blue Normal 1/2Blue Normal 1/2Blue
light
light
light
低輝度
通常輝度
高輝度
(3)
(5)
(4)
テレビの視聴によるメラトニン分泌量の変化
通常輝度、高輝度条件
Normal群において有意なメラトニン分泌量の減少が見られたが、1/2Blue light群
においてはその分泌抑制が見られない。
⇒メラトニン分泌抑制の分光感度特性
低輝度条件
照度が低いため十分な分泌抑制が見られない。
（２）温度
Deviation from moving average
温度と時計遺伝子の関係性
mPer2::Lucの様子
細胞
組織培養
30 min at 43 ˚C
Time post the treatment (hours)
(Tamaru et al. 2011)
中枢
時計
末梢
時計
150 min at
40˚C
(Kornmann et al.200
SCN
生体内
温度
目的： in vivoにおいて短時間の温度刺激が抹消時計に与える影
響を検証
水浴方法・深部体温測定方法
water
incub
ator
&
mixer
温度センサー
を手術により埋め込んだ位置
26-28mm
6.7mm四方の金網
Onishi et al., PLoS ONE, 2014
４１℃の水浴では体内時計の位相を変えうる
○実験条件○
ZT- 4-6 で処置
control
37˚C
41˚C
2日間後、IVIS
core body temperature
(˚C)
42
41℃
41
40
control(24
℃)
39
38
37 ˚Cとcontrolの体温は似ている
41˚Cでは体温を40˚C以上を保っている
37
36
0:00
統計処理
Tukey Kramer
#p<0.05 vs control
##p<0.01 vs control
$p<0.05 vs 37˚C
2:00
4:00 6:00
ZT
8:00
飼育環境気温を35 ˚Cでは、体内時計の位相を動かさない
○実験条件○
ZT- 4-6の間に
温度調整可能なボックスの中を
35˚Cに設定し、マウスを入れた。
2日間処置後、IVIS
比較対象はintact
ZT4-6
35˚C
core body temperature (˚C)
42
41℃
水浴
41
35℃
40
39
38
環境気温35˚Cでは
深部体温を40 ˚C以上に保てない
37
36
0:00
2:00
4:00
6:00
8:00
（３）食事
体内時計の仕組み
主時計
光同調
視交叉上核
非光刺激
繰り返しの
給餌刺激
メタンフェタミン
脳内/末梢組織
睡眠・覚醒
体温
ホルモン
代謝
網膜
光刺激
脳・末梢時計
DMH ?
VTA/ACC？
＜control群＞
240
200
160
120
80
40
0
餌
腎臓
肝臓
顎下腺
240
200
160
120
80
40
0
ZT9 ZT13 ZT17 ZT21 ZT1 ZT5
腎臓
肝臓
顎下腺
＜RF2日群＞
ZT9 ZT13 ZT17 ZT21 ZT1 ZT5
顎下腺
240
200
160
120
80
40
0
ZT9 ZT13 ZT17 ZT21 ZT1 ZT5
240
200
160
120
80
40
0
肝臓
ZT9 ZT13 ZT17 ZT21 ZT1 ZT5
＜RF1日群＞
240
200
160
120
80
40
0
腎臓
腎臓
肝臓
顎下腺
ZT9 ZT13 ZT17 ZT21 ZT1 ZT5
240
200
腎臓 160
120
肝臓
80
顎下腺
40
0
腎臓
肝臓
顎下腺
ZT9 ZT13 ZT17 ZT21 ZT1 ZT5
DMHは腹時計である
Sham
Lesion 1
Lesion 2
給餌時間
0
12
0
ZT
12
0
12
0
ZT
12
0
12
0
ZT
Tahara et al., Journal of Biological Rhythm, 2010
12
ダラダラ食いは体内時計をリセットしない
摂餌パターン
腎臓
６食
6point
4point
４食
自由摂食
肝臓
６食
４食
自由摂食
顎下腺
６食
４食
自由摂食
Peak Time [ZT]
1日を均等にして、1日6食、4食の間に差は認めらない
1日４食以上の食事では均等に食べていると、体内時計のリセットがおこらない
様々な人の食生活に対応させてみる
肝臓
19
19
7
理想的な体内時計のpeak
自由摂食
FF
9
1
8時間おきに1日3食
非活動期に1日3食
19
13
3食比は
1: 1: 1
7
13
3食比は
1: 1: 1
7
12
7
12
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24
Zeitgeber Time
5
21
17
1
7
朝：昼：夕＝19: 1: 7
活動期に1日3食
19
朝：昼：夕＝7: 13: 19
20
朝：昼：夕＝7: 12: 20
22
朝：昼：夕＝7: 12: 22
0
2
4
Kuroda et al., Scientific reports, 2012
3食比は
1: 1.3: 1.3
どうしても夜遅くに食べなければ
いけない時の打開策！
夜遅くに一食食べるよりも、魔の時間(夜中)を避けて
分食すると体内時計が乱れにくくなる
Kuroda et al., Scientific reports, 2012
読売新聞
10月7日、2012年
山中先生、ノーベル賞
１０月9日
夜食症モデルマウス
ZT0
ZT5
ZT12
自由摂食群
（FF群）
ZT24
ND
ND
夜食症候群
（NES群）
HFD
体重推移[g]
40
38
36
34
32
FF
RF
1min
1min
30
28
1h
1h
1h
30min 30min 15min 15min
5min
5min
Ｈａｒａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｒｏｎｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．， ２０１４
夜間の５分間の高脂肪食摂食でも、時計が同調され、肥満を起こす
摂食量(HFD)[g/mouse/day]
3
2
1
0
1h
1h
1h
腎臓
200
30min 30min 15min 15min 5min 5min 1min 1min
FF
肝臓
RF 5分
RF 2分
200
100
100
0
0
ZT7 ZT11 ZT15 ZT19 ZT23 ZT3
ZT7 ZT11 ZT15 ZT19 ZT23 ZT3
昼間に餌をやる（夜食）条件の学習実験
体内時計は、時差ボケ下の実験になっている
（４）ストレス・運動
昼間の拘束ストレスは体内時計を前進させる
２時間（拘束ストレス）
（３日間）
Kidney
４日目、ＩＶＩＳ
Liver
拘束群
対照群
SG
11
13
15
17
19
21
23
ケージ交換などのマイルドストレスは体内時計を動かさない
[ZT]
自由輪回し運動はマウスの末梢臓器体内時計
の位相を動かさない
使用動物
PER2::LUC knock-in mouse
♂
各群 n=4
実験スケジュー
ル
ZT0
12
～day0
1week)
Free Ex
ZT9
実験群
①No Ex
(cont.)
②Free Ex
No Ex
腎臓
Free Ex
24
肝臓
FF
day1
Free Ex
PER2 ピーク時刻
IVISによる計測
顎下腺
day2
16
18
[ZT]
20
22
まとめ
（１）
明暗環境をきちんと維持する。 白色ＬＥＤは良くない。
どうしても、夜間に動物室に入る場合は、赤色光を用いる。
（２） 明暗環境を変化させて実験をする場合、７-１０日必要である。
（３） 湿度変化、温度変化、雑音変化はリズムに影響しない。
（４）マウスの非活動期（昼間）に、餌、ストレスを与えると、体内時計が
ずれる可能性がある。特に高脂肪食は時計を動かしやすい。
（５） 餌・水の補給、ケージ交換は毎日同じ時間にせず、ランダムに行う。
（６）動物実験を行うに当たって、１日の中でのタイミングの重要性を研究者に伝える。