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〔生化学 第８
５巻 第６号，pp.４
０
５―４
１
３，２
０
１
３〕
!!!
特集：次世代シグナル伝達研究―先駆的基礎解析と臨床・創薬への展開―
!!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
ポリユビキチン鎖を標的とした NF-κB の新たな調節機構
柴
田
佑
里，井
上
純 一 郎
ユビキチン修飾は，タンパク質分解，DNA 修復，メンブレントラフィック，シグナル
伝達など，様々な生命現象に関わる翻訳後修飾として知られている．転写因子 NF-κB 活
性化経路では，シグナル伝達におけるポリユビキチン鎖の機能解析が進んでおり，NF-κB
活性化時にポリユビキチン化される分子とそのポリユビキチン鎖の役割，ポリユビキチン
化タンパク質の制御機構に関する研究が盛んに行われている．NF-κB 活性化には IKK 複
合体調節サブユニット NEMO のポリユビキチン化が重要であるが，近年，我々は p４
７
（NSFL１C）がポリユビキチン化 NEMO の量を制御し，IKK 複合体活性化を抑制すること
を明らかにした．p４
７は，既知の NF-κB 抑制分子 CYLD や A２
０とは異なる様式で IKK 複
合体活性化を抑制するのだが，本稿ではその抑制機構について紹介する．
１． は
じ
め
に
２． NF-κB について
nuclear factor-κB（NF-κB）は，炎症性サイトカイン，ケ
NF-κB は五つのファミリー分子 p６
５（RelA）
，RelB，c-
モカイン，抗アポトーシス分子，増殖因子などの発現を制
Rel，p５
０／p１
０
５（NF-κB１）
，p５
２／p１
０
０（NF-κB２）で 構 成 さ
御する転写因子で，炎症反応，免疫応答，細胞分化や増殖
１）
れている（図１A）
．NF-κB ファミリー分子は，N 末端側
といった様々な生命現象に関与している１）．その一方で，
の Rel ホモロジードメイン（RHD）を介してホモあるいは
制御不全による恒常的な NF-κB 活性化は炎症性疾患やが
ヘテロ二量体を形成し，DNA に結合する．転写活性化ド
んの原因となるため，NF-κB の活性化は一過性となるよ
メインは p６
５，RelB，c-Rel のみに存在し，p５
０や p５
２には
うに厳密に制御される必要がある２，３）．
存在しない．そのため，転写活性化能を示す NF-κB には
タンパク質の翻訳後修飾は，細胞内シグナル伝達におい
少なくとも一つの p６
５，RelB，c-Rel が含まれている必要
て重要な機能を果たしている．NF-κB 活性化経路では主
がある．また，p５
０や p５
２は前駆体 p１
０
５，p１
０
０として産
に二つの翻訳後修飾，リン酸化とユビキチン化がシグナル
生された後，限定分解を受けて成熟する（図１A）
．
伝達に必要である４）．本稿では，NF-κB 活性化経路におけ
不活性化時，NF-κB の RHD には，アンキリンリピート
るポリユビキチン鎖の機能を，これまでの知見を中心に概
を介して inhibitor of NF-κB（IκB）ファミリーや NF-κB 前
説するとともに，近年我々が報告したポリユビキチン鎖を
駆体（p１
０
０，p１
０
５）が結合している．その結果，RHD 内
標的とする NF-κB の新たな制御機構について紹介する．
の核移行シグナルが遮蔽されて，NF-κB は細胞質内に繋
留される．NF-κB の活性化は，IκB ファミリーの分解また
東京大学医科学研究所分子発癌分野（〒１
０
８―８
６
３
９ 東京
都港区白金台４―６―１）
A novel NF-κB regulatory mechanism targeting a polyubiquitin chain
Yuri Shibata and Jun-ichiro Inoue（Division of Cellular and
Molecular Biology, The Institute of Medical Science, The
University of Tokyo,４―６―１Shirokanedai, Minato-ku, Tokyo
１
０
８―８
６
３
９, Japan）
は NF-κB 前駆体の限定分解が引き金となって誘導される
が，その活性化経路は古典的経路（canonical pathway）と
非古典的経路（non-canonical pathway）の二つに大別する
ことができる（図１B）
．古典的経路の活性化は，キナーゼ
活性をもつ IκB kinase（IKK）α と IKKβ，調節サブユニッ
ト NF-κB essential modulator（NEMO）から構成される IKK
複合体によって厳密に制御されている４）．腫瘍壊死因子 α
４
０
６
〔生化学 第８
５巻 第６号
（TNF-α）やインターロイキン１（IL-１）などのサイトカイ
kinase（NIK）によって IKKα ホモ二量体が活性化する．
ン，リポポリ多糖（LPS）などの細菌由来分子，ウイルス
IKKα は p１
０
０のリン酸化を誘導し，このリン酸化を指標
由 来 の RNA や DNA に よ っ て IKK 複 合 体 は 活 性 化 し，
として p１
０
０が p５
２へと限定分解され る と，主 に RelB，
IκBα のリン酸化，プロテアソームによる分解を誘導する．
p５
２で構成される NF-κB が活性化する５）．古典的経路は刺
その結果，主に p６
５，p５
０で構成される NF-κB の核移行シ
激後数分で活性化が誘導され，炎症性サイトカイン，ケモ
グナルが露出して核内に移行し，標的遺伝子の転写を促進
カインなどの発現を促進する．一方，非古典的経路の活性
する．一方，非古典的経路の活性化は IKKα のホモ二量体
化は古典的経路と比べて遅く，活性化に数時間を要する．
に よ っ て 制 御 さ れ て い る．receptor activator of NF-κB
非古典的経路はケモカインやリンパ系器官の形成に必要な
（RANK）リガンド，CD４
０リガンド，B cell-activating factor
遺伝子の発現を制御している．
（BAFF）
，
リンホトキシン β（LT-β）刺激後，
NF-κB-inducing
図１ NF-κB ファミリーと NF-κB 活性化経路
（A）NF-κB ファミリーと IκB ファミリーの模式図．RHD：Rel ホモロジードメイン，TAD：転写活性化ドメイン，LZ：ロイ
シンジッパー，GRR：グリシンリッチ領域．p１
０
５，p１
０
０は C 末端から GRR 付近まで限定分解されて，p５
０，p５
２に成熟する．
（B）NF-κB 活性化経路の模式図．
４
０
７
２
０
１
３年 ６月〕
３． ユビキチン修飾系について
鎖状に連なったポリユビキチン鎖が修飾される場合は，ポ
リユビキチン化と呼ばれる．ポリユビキチン鎖は，ユビキ
ユビキチン修飾系は，ユビキチン活性化酵素（E１）
，ユ
チンのリシン残基を介して，ユビキチン同士が繰り返し結
ビキチン結合酵素（E２）
，ユビキチンリガーゼ（E３）の連
合することで形成される．ユビキチンには７個のリシン残
続的な酵素反応によって，ユビキチンが基質分子に付加さ
基（K６，K１
１，K２
７，K２
９，K３
３，K４
８，K６
３）が存在する．
れる反応である（図２）
．この反応は，ATP 依存的に活性
質量分析計を用いた解析により，生体内では７個それぞれ
化したユビキチンが，E１活性部位のシステインとチオエ
のリシン残基を介したポリユビキチン鎖の存在が示されて
ステル結合を形成することで開始する．その後，E１に結
いるが８），これらポリユビキチン鎖のうち K４
８結合型，
合したユビキチンは E２活性部位のシステインに転移す
K６
３結合型ポリユビキチン鎖の機能解析が進んでいる．
る．そして，最終的に E３が E２と基質分子に結合して，
K４
８結合型ポリユビキチン鎖はプロテアソームによるタ
基質分子のリシン残基側鎖の ε-アミノ基とユビキチンの C
ンパク質分解の標識として機能し，K４
８結合型ポリユビキ
末端間にイソペプチド結合を形成する６）．基質のリシン残
チン化タンパク質はプロテアソームに認識されて分解され
基に１分子のユビキチンが結合する場合はモノユビキチン
る９）．一方で，K６
３結合型ポリユビキチン鎖は分解の標識
化と呼ばれ，モノユビキチン化はメンブレントラフィック
にはならず，シグナル伝達や DNA 修復に関与する１０）．他
７）
やヒストン制御に関与する ．一方，多数のユビキチンが
図２ ユビキチン修飾系
の型のポリユビキチン鎖に関しては，K１
１結合型ポリユビ
４
０
８
〔生化学 第８
５巻 第６号
キチン鎖はプロテアソームによるタンパク質分解と NF-
（TIR）ド メ イ ン に myeloid differentiation primary gene８
８
κB 活性化に関与することが報告されているが１１），K６結合
（MyD８
８）が 結 合 す る（図３）
．そ の 後，MyD８
８に IL-１
型，K２
７結合型，K２
９結合型，K３
３結合型ポリユビキチン
receptor-associated kinase（IRAK）
１，IRAK４が結合した後，
鎖の機能は依然として明確になっていない．また，近年，
この複合体に TNF receptor-associated factor６（TRAF６）が
リシン残基側鎖のアミノ基に加えて，ユビキチン N 末端
リクルートされる４）．TRAF６はユビキチンリガーゼとして
メチオニン（Met１）の α-アミノ基を介したポリユビキチ
機能し，E２の Ubc１
３／Uev１A とともに K６
３結合型ポリユ
ン鎖が報告され，これは直鎖状ポリユビキチン鎖と呼ばれ
ビキチン鎖を形成する１５）．これまでに，TRAF６は TRAF６
１
２）
ている ．直鎖状ポリユビキチン鎖は K６
３結合型，K１
１結
合型と同様に NF-κB 活性化に関与する（詳細は徳永の稿
１
３）
自 身１６）， transforming growth factor-β-activated kinase １
１
７）
（TAK１）
，NEMO の K６
３結合型ポリユビキチン化を誘導
を参照） ．現在までに，ポリユビキチン鎖の立体構造解
することが報告されている１８）．TAK１のアダプター分子
析が積極的に行われており，各ポリユビキチン鎖は異なる
TAK１-binding（TAB）２／３や NEMO のユ ビ キ チ ン 結 合 ド
立体構造をとることが明らかとなっている１４）．立体構造の
メインを介して，ポリユビキチン鎖を足場にシグナル複合
違いによって，各ポリユビキチン鎖は異なるタンパク質に
体が形成される結果，TAK１の活性化，IKK 複合体の活性
認識され，異なる経路で機能すると考えられている．どの
化が誘導される４）．リン酸化 IκBα のポリユビキチン化は
リシン残基を介してポリユビキチン鎖が形成されるかに
SCFβ-TrCP ユビキチンリガーゼが触媒する．この場合，IκBα
よってポリユビキチン鎖の機能が全く異なり，ユビキチン
は K４
８結合型ポリユビキチン化を受け，その後プロテア
は多彩な役割を果たすことができる．
ソームで分解される１）．
４． NF-κB 活性化経路におけるポリユビキチン鎖の
役割
一方，TNFR１にリガンドの TNF-α が結合すると，受容
体 下 流 に TNFR１-associated death domain protein（TRADD）
，
TRAF２／５，cellular inhibitor of apoptosis protein（c-IAP）１／
次に，NF-κB 活性化経路においてポリユビキチン鎖が
２，receptor-interacting protein kinase １（RIP１）がリクルー
どのように機能しているのか，IL-１受容体（IL-１ receptor：
トされる４）．c-IAP１／２はユビキチンリガーゼとして機能
IL-１R）
／Toll 様受容体（Toll-like receptor：TLR）と¿型 TNF
し，RIP１の K１
１および K６
３結合型ポリユビキチン化を誘
受容体（TNF receptor１：TNFR１）の二つのシグナル伝達
導する１１，１９）．すると，IL-１R／TLR 経路同様に，ポリユビキ
経路について説明したい．リガンドが受容体に結合する
チン鎖を足場としてシグナル複合体が形成され，TAK１，
と，IL-１R と TLR の 細 胞 内 領 域 に 存 在 す る Toll-IL-１R
IKK 複合体が活性化する．
図３ IL-１R／TLR シグナル伝達経路と TNFR１シグナル伝達経路
４
０
９
２
０
１
３年 ６月〕
さらに，IL-１R／TLR や TNFR１シグナル伝達経路では，
p４
７は３
７
０個のアミノ酸からなる約４
０kDa のタンパク
IKK 複合体活性化における NEMO の直鎖状ポリユビキチ
質で，もともと ATP アーゼ p９
７（VCP）の補助因子とし
ン化の重要性が明らかとなっている．直鎖状ポリユビキチ
て同定された２４）．p４
７は三つのドメインから構成されてお
ン鎖はユビキチンリガーゼ linear ubiquitin chain assembly
り，N 末端 に ubiquitin-associated（UBA）ド メ イ ン，中 央
complex（LUBAC）に よ り 形 成 さ れ る．LUBAC は，
に shp１, eyc and p４
７（SEP）ドメイン，C 末端に ubiquitin
TRADD，TRAF２，c-IAP１／２依 存 的 に TNFR１に リ ク ル ー
regulatory X（UBX）ドメインを有している２５）．p４
７はユビ
トされ，NEMO の直鎖状ポリユビキチン化，IKK 複合体
キチン結合ドメインである UBA ドメインを介してユビキ
活性化を誘導する１３）．上述のように，NF-κB 活性化経路で
チンと結合する．SEP ドメインは p４
７ショウジョウバエホ
は非分解性のポリユビキチン鎖がアダプターとして機能
モログの eyc，p４
７出芽酵母ホモログ shp１，p４
７に保存さ
し，シグナル伝達複合体形成に寄与している．
れている配列で，他のタンパク質に類似する配列は存在し
NF-κB 活性化を抑制するためには，ポリユビキチン化
ない．SEP ドメインは p４
７の多量体化に関与すること，
タンパク質を制御する必要があるのだが，その制御はどの
UBX ドメインは p９
７との結合に必要であることが示され
ような機構で行われているのか．これまでに，脱ユビキチ
ている２６）．また，これまでの解析から，p４
７は p９
７と協調
ン化酵素 A２
０や CYLD が NF-κB 活性化を抑制する分子と
してゴルジ体の膜形成に関与することが示されていた
して報告されている．CYLD は K６
３結合型および直鎖状
が２４），NF-κB 活性化経路への関与は明らかとなっていな
ポリユビキチン鎖を特異的に切断することで，IKK 複合
かった．IKK 複合体の活性化には非分解性のポリユビキ
体活性化を負に制御する１０，２０）．A２
０も CYLD 同様に，IKK
チン鎖が重要であることから，ユビキチン結合ドメインを
複合体の抑制には脱ユビキチン化活性が必要であると考え
有する p４
７は IKK 複合体活性化の制御に関与しているの
られてきたが，近年，A２
０は脱ユビキチン化活性非依存的
ではないかと考えて，このタンパク質に注目した．
２
１，
２
２）
．し
ま ず，p４
７が IKKα，IKKβ，NEMO の う ち，ど の IKK
たがって，NF-κB 活性化経路におけるポリユビキチン化
複合体構成因子に結合するか検討した．HEK２
９
３T 細胞に
タンパク質の制御は，現在考えられているモデルよりも複
Flag タ グ 付 加 p４
７と HA タ グ 付 加 IKKα，IKKβ ま た は
雑である可能性が高い．
NEMO を強制発現させた後，抗 HA 抗体を用いた共免疫
に IKK 複合体活性化を抑制することが報告された
５． 新規 IKK 複合体結合タンパク質の同定
IKK 複合体は７
０
０∼９
０
０kDa の大きな複合体を形成する
沈降実験を行った．その結果，p４
７は IKKα，IKKβ とは結
合せず，NEMO に結合することが明らかとなった（図４
A）
．さらに，抗 NEMO 抗体を用いた共免疫沈降実験によ
が，刺激依存的に IKK 複合体に結合する分子の全容は明
り，内在性の p４
７と IKK 複合体が刺激依存的に結合する
らかとなっていない．そこで，IKK 複合体活性化制御に
ことを確認した（図４B）
．以上の結果から，p４
７はサイト
関わる新たな分子を探索するために，活性化した IKK 複
カイン刺激依存的に NEMO を介して IKK 複合体に結合す
合体に含まれる分子を質量分析により解析した．その結
ることが示唆された．
果，新規 IKK 複合体結合タンパク質として p４
７（NSFL１C）
を同定した２３）．
図４ p４
７は NEMO を介して IKK 複合体に結合する
（A）p４
７と各 IKK 複合体構成因子の結合．HEK２
９
３T 細胞に Flag タグ付加 p４
７と HA タグ付加 IKKα，
IKKβ，NEMO を強制発現させた後，抗 HA 抗体を用いて共免疫沈降を行った．その後，抗 Flag 抗体を
用いたウェスタンブロッティングにより各 IKK 複合体構成因子に結合している p４
７を検出した．
（B）内在性 p４
７と IKK 複合体の結合．HeLa 細胞を TNF-α（１
０ng／ml）で表記の時間処理した後，抗
NEMO 抗体を用いて共免疫沈降を行った．その後，抗 p４
７抗体を用いたウェスタンブロッティングによ
り IKK 複合体に結合している p４
７を検出した．
４
１
０
〔生化学 第８
５巻 第６号
６． p４
７の NF-κB 活性化経路における機能
ΔUBA，p４
７-ΔUBA／SEP）を作製し，野生型 p４
７
（p４
７-WT）
と p４
７変異体の NF-κB 抑制能を NF-κB レポーターアッセ
p４
７が IKK 複合体活性化制御に関与するか検討するため
イにより確認した．p４
７-ΔUBX は p４
７-WT と同程度に NF-
に，siRNA を用いて内在性 p４
７の発現を抑制し，サイトカ
κB 活性化を抑制したのに対して，UBA ドメインを欠損さ
イン刺激後の IκBα のリン酸化，分解をウェスタンブロッ
せた p４
７-ΔUBA，p４
７-ΔUBA／SEP は NF-κB 抑制能が顕著
ティングにより確認した．その結果，p４
７の発現を抑制す
に低下した（図６B）
．この結果から，p４
７のユビキチン結
ると，TNF-α 刺激により誘導される IκBα のリン酸化が増
合能が NF-κB 活性化の抑制に必要であることが示された．
大し，それに伴い IκBα の分解が亢進していた（図５A）
．
p４
７の p９
７結合能は NF-κB の抑制には必要ないのだが，
興味深いことに，CYLD や A２
０が欠損したマウス胎仔繊
p９
７が NF-κB 活性化制御に関与しないことは，siRNA を
維芽細胞（MEF）においても，p４
７ノックダウンによる IKK
用いて内在性 p９
７の発現を抑制した実験により確認してい
複合体活性化の亢進が観察された（図５B）
．この結果から，
る２３）．
p４
７は CYLD，A２
０とは異なる経路で IKK 複合体活性化を
上述の結果と，p４
７が結合する NEMO はサイトカイン
抑制することが考えられる．次に，p４
７の発現を抑制した
刺激依存的にポリユビキチン化されることから，p４
７は
際の NF-κB 活性化を評価するために，NF-κB 標的遺伝子
UBA ドメインを介してポリユビキチン化 NEMO に結合す
（IL８，TNFA）の転写産物量をリアルタイム PCR により測
るのではない か と 仮 説 を 立 て た．組 換 え UBE１（E１）
，
定した．内在性 p４
７の発現を抑制した場合，TNF-α 刺激
Ubc１
３／Uev１A（E２）
，TRAF６（E３）
，NEMO（基 質）を 用
によって誘導される IL８，TNFA の産生量が増加した（図
いて，in vitro において NEMO のポリユビキチン化を誘導
５C）
．以上の結果から，p４
７は IKK 複合体を標的として
した後，ポリユビキチン化 NEMO と p４
７が結合するか確
NF-κB 活性化を負に制御することが示された．
認した．p４
７はポリユビキチン化されていない NEMO に
７． p４
７による IKK 複合体活性化抑制機構
は結合せず，ポリユビキチン化依存的に NEMO に結合し
た（図６C）
．さらに，p４
７-ΔUBA や UBA ドメインに三つ
p４
７が IKK 複合体活性化を抑制するメカニズムを解析す
の点変異を加えた p４
７変異体（p４
７-V１
５A／L３
４A／Y４
２A）は
るために，p４
７のどの機能ドメインが NF-κB 活性化の抑
ポリユビキチン化 NEMO に結合できなくなることから，
制に必要であるか検討を行った．図６A に示すように，
p４
７は UBA ドメインを介してポリユビキチン化 NEMO に
p４
７の各ドメインを欠損させた変異体（p４
７-ΔUBX，p４
７-
結合することが示唆された．さらに，p４
７が結合するポリ
図５ p４
７は IKK 複合体，NF-κB 活性化を負に制御する
（A）siRNA を用いて内在性 p４
７の発現を抑制した HeLa 細胞を TNF-α（１．
０ng／ml）で表記の時間処理した．その後，抗リン酸化
IκBα 抗体と抗 IκBα 抗体を用いたウェスタンブロッティングにより，IκBα のリン酸化と分解を検出した．
（B）野生型または Cyld，A２
０ 欠損 MEF に siRNA を導入して，内在性の p４７の発現を抑制した．TNF-α（３．
０ng／ml）で表記の時間
処理した後， 抗リン酸化 IκBα 抗体と抗 IκBα 抗体を用いたウェスタンブロッティングにより， IκBα のリン酸化と分解を検出した．
（C）siRNA を用いて内在性 p４
７の発現を抑制した HeLa 細胞を TNF-α（１
０ng／ml）で表記の時間処理した．その後，リアルタイム
PCR を行って，NF-κB 標的遺伝子の転写産物量を測定した．＊＊＊P＜０．
０
１，＊＊P＜０．
０
２，＊P＜０．
０
５．
４
１
１
２
０
１
３年 ６月〕
図６ p４
７のユビキチン結合能が IKK 複合体の抑制に必要である
（A）p４
７変異体の模式図．
（B）siRNA を用いて内在性 p４
７の発現を抑制した HEK２
９
３T 細胞に野生型 p４
７または各 p４
７変異体，NF-κB レポーター
を導入した．その後，細胞を TNF-α（１．
０ng／ml）で処理し，ルシフェラーゼアッセイにより NF-κB 転写活性を測定し
た．NS：not significant.＊＊＊P＜０．
０
１，＊＊P＜０．
０
２，＊P＜０．
０
５．
（C）組換え UBE１（E１）
，Ubc１
３／Uev１A（E２）
，TRAF６（E３）
，NEMO（基質）を用いて，in vitro において NEMO のポリ
ユビキチン化を誘導した．抗 NEMO 抗体を用いた免疫沈降によりポリユビキチン化 NEMO を回収し，ポリユビキチン
化 NEMO に組換え野生型 p４
７または p４
７変異体が結合するかどうか結合実験を行った．
（D）組換え p４
７と各型のポリユビキチン鎖（Ub２∼Ub７）を混合して，in vitro において結合実験を行った．その後，NiNTA アガロースを用いて p４
７を回収し，p４
７に結合しているポリユビキチン鎖をウェスタンブロッティングにより検出
した．
ユビキチン鎖の型に特異性があるかどうか検討するため
現量が回復した２３）．この結果から，p４
７はリソソーム依存
に，in vitro において組換え p４
７と K４
８結合型，K６
３結合
的な経路を介して NEMO の分解を誘導することが示唆さ
型，直鎖状ポリユビキチン鎖（ジユビキチンからヘプタユ
れた．また，内在性 p４
７の発現を抑制すると，TNF-α 刺
ビキチン：Ub２∼Ub７）が結合するか確認した．p４
７は K４
８
激により誘導されるポリユビキチン化 NEMO が蓄積し（図
結合型テトラユビキチンに結合するものの，NEMO が修
７B）
，E６
４D とペプスタチン A 処理でも同様の結果が得ら
飾を受ける型の K６
３結合型，直鎖状ポリユビキチン鎖に
れた（図７C）
．さらに，NEMO とリソソームマーカータ
優先的に結合することが明らかとなった（図６D）
．
ンパク質 lysosomal-associated membrane protein１
（LAMP-１）
こ れ ま で の 結 果 か ら，p４
７は ポ リ ユ ビ キ チ ン 化 し た
の局在を共焦点蛍光顕微鏡により確認し，TNF-α 刺激依
NEMO の発現量を制御することにより IKK 複合体活性化
存的に NEMO がリソソームに局在することも明らかにし
を抑制することが推察された．そこで，p４
７が各 IKK 複合
て い る２３）．以 上 の 結 果 よ り，p４
７は ポ リ ユ ビ キ チ ン 化
体構成因子の発現量に影響を与えるかどうか検討するため
NEMO のリソソーム分解を誘導して，IKK 複合体活性化
に，HEK２
９
３T 細胞に p４
７と各 IKK 複合体構成因子を強制
を負に制御することが明らかになった（図７D）
．
発現し，その発現量を確認した．p４
７は IKKα，IKKβ の発
また，多くのがん細胞では，NF-κB 制御機構の破綻が
現量に影響を与えなかったが，p４
７強制発現によりポリユ
原因となって，恒常的に NF-κB が活性化している．そこ
ビキチン化 NEMO の量が減少した（図７A）
．このとき，
で，そのようながん細胞において p４
７の発現量がどのよう
プロテアソーム阻害剤 MG１
３
２処理では NEMO の発現量
になっているか検討を行った．その結果，NF-κB が恒常
は回復しなかったが，リソソーム阻害剤 E６
４D とペプスタ
的に活性化している成人 T 細胞白血病細胞において，p４
７
チン A で処理すると，p４
７によって減少した NEMO の発
の発現が低下していることを見いだした２３）．この結果か
４
１
２
〔生化学 第８
５巻 第６号
図７ p４
７はポリユビキチン化 NEMO のリソソーム分解を誘導する
（A）HEK２
９
３T 細胞に Flag タグ付加 p４
７（０．
１，０．
３，１．
０μg）と各 IKK 複合体構成因子（０．
１μg）を発現させた後，ウェスタンブ
ロッティングにより各 IKK 複合体構成因子の発現量を検出した．
（B）siRNA を用いて内在性 p４
７の発現を抑制した HeLa 細胞を TNF-α（１
０ng／ml）で表記の時間処理した．その後，抗 NEMO 抗体
を用いて免疫沈降を行い，ポリユビキチン化 NEMO をウェスタンブロッティングにより検出した．
（C）HeLa 細胞をリソソーム阻害剤 E６
４D（５．
０μg／ml）
／ペプスタチン A（１．
０μg／ml）またはプロテアソーム阻害剤 MG１
３
２（１
０μM）
で処理した後，細胞を TNF-α（１
０ng／ml）で表記の時間処理した．抗 NEMO 抗体を用いて免疫沈降を行い，ポリユビキチン化
NEMO をウェスタンブロッティングにより検出した．
（D）p４
７による IKK 複合体抑制機構の模式図．
ら，p４
７の発現低下が恒常的な NF-κB 活性化，細胞悪性
る選択的オートファジーが注目されている２８）．これまで，
化につながる可能性が示唆された．
オートファジーは非選択的に細胞質成分を分解すると考え
８． 今 後 の 展 望
られてきたが，ポリユビキチン化タンパク質が選択的に
オートファゴソームに封入され，分解されることが明らか
これまで K６
３結合型ポリユビキチン化タンパク質の制
となってきている．実際に，T-cell receptor（TCR）下流の
御は脱ユビキチン化酵素が担っていると考えられてきた．
NF-κB 活性化経路において，K６
３結合型ポリユビキチン
しかし，本研究の結果から，脱ユビキチン化酵素によるポ
化 Bcl-１
０が選択的オートファジーにより分解されること
リユビキチン鎖の切断に加え，ユビキチン化タンパク質の
が示されている２９）．今後も，ポリユビキチン化タンパク質
分解も K６
３結合型ポリユビキチン化タンパク質の制御に
の制御に関して興味深い展開が期待される．
重要な役割を果たしていると考えられる．本研究以外で
また，p４
７に関しては in vivo における機能の解析が今
も，K６
３結合型ポリユビキチン鎖がリソソームを介したタ
後の課題である．p４
７欠損マウスを作製し，炎症応答や発
ンパク質分解に関与している可能性が示唆されている．６
３
がんにおける p４
７の役割を調べたいと考えている．
番目以外のリシンをアルギニンに置換し，K６
３結合型ポリ
ユビキチン鎖のみが形成されるユビキチンを細胞に導入す
文
献
ると，ポリユビキチン化タンパク質がリソソームに蓄積す
ることが示されている２７）．また，リソソームを介したタン
パク質分解経路としてオートファジーがよく知られている
が，近年，基質が選択的にオートファゴソームに封入され
３
４.
１）Hayden, M.S. & Ghosh, S.（２
０
１
２）Genes Dev.,２
６,２
０
３―２
２）Pasparakis, M.（２
０
０
９）Nat. Rev. Immunol.,９,７
７
８―７
８
８.
３）Perkins, N.D.（２
０
１
２）Nat. Rev. Cancer,１
２,１
２
１―１
３
２.
２
０
１
３年 ６月〕
４）Liu, S. & Chen, Z.J.（２
０
１
１）Cell Res.,２
１,６―２
１.
５）Sun, S.C.（２
０
１
０）Sci. Signal.,３, pe１
８.
６）Pickart, C.M.（２
０
０
１）Annu. Rev. Biochem.,７
０,５
０
３―５
３
３.
７）Haglund, K., Di Fiore, P.P., & Dikic, I.（２
０
０
３）Trends Biochem. Sci.,２
８,５
９
８―６
０
３.
８）Xu, P., Duong, D.M., Seyfried, N.T., Cheng, D., Xie, Y.,
Robert, J., Rush, J., Hochstrasser, M., Finley, D., & Peng, J.
（２
０
０
９）Cell,１
３
７,１
３
３―１
４
５.
９）Komander, D. & Rape, M.（２
０
１
２）Annu. Rev. Biochem., ８
１,
２
０
３―２
２
９.
１
０）Chen, Z.J. & Sun, L.J.（２
０
０
９）Mol. Cell,３
３,２
７
５―２
８
６.
１
１）Dynek, J.N., Goncharov, T., Dueber, E.C., Fedorova, A.V.,
Izrael-Tomasevic, A., Phu, L., Helgason, E., Fairbrother, W.J.,
Deshayes, K., Kirkpatrick, D.S., & Vucic, D.（２
０
１
０）EMBO
J.,２
９,４
１
９
８―４
２
０
９.
１
２）Kirisako, T., Kamei, K., Murata, S., Kato, M., Fukumoto, H.,
Kanie, M., Sano, S., Tokunaga, F., Tanaka, K., & Iwai, K.
（２
０
０
６）EMBO J.,２
５,４
８
７
７―４
８
８
７.
１
３）Tokunaga, F. & Iwai, K.（２
０
１
２）Microbes Infect., １
４, ５
６
３―
５
７
２.
１
４）Kulathu, Y. & Komander, D.（２
０
１
２）Nat. Rev. Mol. Cell Biol.,
１
３,５
０
８―５
２
３.
１
５）Deng, L., Wang, C., Spencer, E., Yang, L., Braun, A., You, J.,
Slaughter, C., Pickart, C., & Chen, Z.J.（２
０
０
０）Cell, １
０
３, ３
５
１―
３
６
１.
１
６）Lamothe, B., Besse, A., Campos, A.D., Webster, W.K., Wu,
H., & Darnay, B.G.（２
０
０
７）J. Biol. Chem.,２
８
２,４
１
０
２―４
１
１
２.
１
７）Yamazaki, K., Gohda, J., Kanayama, A., Miyamoto, Y.,
Sakurai, H., Yamamoto, M., Akira, S., Hayashi, H., Su, B., &
Inoue, J.（２
０
０
９）Sci. Signal.,２, ra６
６.
１
８）Sebban-Benin, H., Pescatore, A., Fusco, F., Pascuale, V.,
４
１
３
Gautheron, J., Yamaoka, S., Moncla, A., Ursini, M.V., & Courtois, G.（２
０
０
７）Hum. Mol. Genet.,１
６,２
８
０
５―２
８
１
５.
１
９）Bertrand, M.J., Milutinovic, S., Dickson, K.M., Ho, W.C., Boudreault, A., Durkin, J., Gillard, J.W., Jaquith, J.B., Morris, S.J.,
& Barker, P.A.（２
０
０
８）Mol. Cell,３
０,６
８
９―７
０
０.
２
０）Komander, D., Reyes-Turcu, F., Licchesi, J.D., Odenwaelder,
P., Wilkinson, K. D., & Barford, D.（２
０
０
９）EMBO Rep., １
０,
４
６
６―４
７
３.
２
１）Skaug, B., Chen, J., Du, F., He, J., Ma, A., & Chen, Z.J.
（２
０
１
１）Mol. Cell,４
４,５
５
９―５
７
１.
２
２）Tokunaga, F., Nishimasu, H., Ishitani, R., Goto, E., Noguchi,
T., Mio, K., Kamei, K., Ma, A., Iwai, K., & Nureki, O.（２
０
１
２）
EMBO J.,３
１,３
８
５
６―３
８
７
０.
２
３）Shibata, Y., Oyama, M., Kozuka-Hata, H., Han, X., Tanaka,
Y., Gohda, J., & Inoue, J.（２
０
１
２）Nat. Commun.,３,１
０
６
１.
２
４）Kondo, H., Rabouille, C., Newman, R., Levine, T.P., Pappin,
D., Freemont, P., & Warren, G.（１
９
９
７）Nature,３
８
８,７
５―７
８.
２
５）Yuan, X., Simpson, P., McKeown, C., Kondo, H., Uchiyama,
K., Wallis, R., Dreveny, I., Keetch, C., Zhang, X., Robinson,
C., Freemont, P., & Matthews, S.（２
０
０
４）EMBO J., ２
３, １
４
６
３―
１
４
７
３.
２
６）Kaneko, Y., Tamura, K., Totsukawa, G., & Kondo, H.（２
０
１
０）
FEBS Lett.,５
８
４,３
８
７
３―３
８
７
７.
２
７）Tan, J.M., Wong, E.S., Kirkpatrick, D.S., Pletnikova, O., Ko,
H.S., Tay, S.P., Ho, M.W., Troncoso, J., Gygi, S.P., Lee, M.K.,
Dawson, V.L., Dawson, T.M., & Lim, K.L.（２
０
０
８）Hum. Mol.
Genet.,１
７,４
３
１―４
３
９.
２
８）Reggiori, F., Komatsu, M., Finley, K., & Simonsen, A.（２
０
１
２）
Int. J. Cell Biol.,２
０
１
２,２
１
９
６
２
５.
２
９）Paul, S., Kashyap, A.K., Jia, W., He, Y.W., & Schaefer, B.C.
（２
０
１
２）Immunity,３
６,９
４
７―９
５
８.