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ISSN 2186-5647
−日本大学生産工学部第47回学術講演会講演概要（2014-12-6）−
P-47
pH 応答型膜透過ペプチドの設計とキャラクタリゼーション
日大生産工(院) ○水野 仁貴 日大生産工 柏田 歩
1 緒言
細胞膜表層との相互作用を引き金に膜構造
を不安定化させる天然ペプチドとして西洋ミ
ツバチ毒の成分である Melittin が知られてい
る。Melittin のアミノ酸配列は大きく分けて
1)N 末端側 1~6 残基目の疎水性領域，2)疎水
性および親水性を有した領域，3)C 末端側
21~26 残基目の親水性領域の 3 つの領域に分
けられる両親媒性ペプチドである(Table 1)1)。
Melittin の膜透過機構は C 末端側に位置する
塩基性アミノ酸(リシンとアルギニン)の側鎖
と細胞膜表層との間の静電相互作用を駆動力
として細胞膜に接近した後，疎水性領域の α
ヘ リ ッ ク ス 形成を伴う膜内への侵入により
達成される 2)。このような膜透過の活性は細
胞膜と同様に脂質二重層を有しているリポソ
ームにも適応可能であると考えられ，Melittin
のような膜透過ペプチドを用いた薬物送達技
術への応用が期待できる。
本研究では，薬物送達系において血液中と細
胞内におけるエンドソーム環境のpHの違いに
注目し，エンドソーム環境において膜透過活性
によるリポソームから内封物漏出が可能な系
の構築を目的とする。そこでMelittinのアミノ
酸配列のうち，C末端側の塩基性アミノ酸を含
む配列を保存し，膜透過に寄与する部位をロイ
シンとアラニンの交互配列に単純化したペプ
チドLPの設計および合成を行い，リポソーム
内封物漏出活性についてを検討した。
Table 1 Amino Acid Sequences of Melittin and
Artifical Membrane Lytic Peptides
2 実験操作
2-1 ペプチドの合成
目的のペプチドは Fmoc 固相合成法によっ
て合成した。なおペプチド合成のための樹脂
は Fmoc-NH-SAL-MBHA Resin を使用し，反
応活性剤として HBTU，HOBt，求核剤として
DIEA を用いた。
2-2 カルセイン封入リポソームの調製
ペプチドの標的として用いるリポソームは
以下のように調製した。はじめにホスファチ
ジルコリン(Egg-PC) に対し，40 mM カルセ
イン水溶液(pH 7.4 および pH 5.0)を所定量添
加した。その後，単純水和法で多層のリポソ
ームを形成させ，凍結融解法によってカルセ
イン溶液を内封した単層リポソームの調製を
行った。さらにサイズを 100 nm に均一にす
るためにエクストルージョンを行い，ゲル濾
過クロマトグラフィーによってカルセイン溶
液内封リポソームの分画を得た。
2-3 カルセイン蛍光測定
ペプチドとリポソームとの親和性を評価す
るためにリポソームに内封したカルセインの
漏出挙動を蛍光測定により観察した。測定開
始 6 min 後にペプチド濃度を 20 M になるよ
うに添加し，
25 min まで 30 sec ごとに測定し，
その後，界面活性剤の Triton X-100 を加えリ
ポソームを破壊し 30 min まで測定を行った。
内封物漏出率は Triton X-100 を添加した際の
最大蛍光強度に対する各時間の蛍光強度の百
分率で表示した。
2-3 円偏光二色性(CD)スペクトル測定
0.1 M Tris-HCl 緩衝液(pH 7.4 および pH 5.0)
中でリポソームを調製し，リポソーム存在下
におけるペプチドの二次構造を調べた。
なお，
Synthesis and characterization of pH-responsive membrane lytic peptides
Mizuno MASAKI and Ayumi KASHIWADA
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3-2 蛍光測定による内封物漏出挙動の確認
カルセイン内封リポソームに LP を添加し
た際の漏出挙動を Figure 1 に示す。pH 7.4 お
よび pH 5.0 いずれの系においてもペプチド
LP の添加とともに蛍光強度の増加がみられ
た。
すなわちカルセインの漏出が確認できた。
この結果から LP はリポソーム表層との静電
相互作用によって接近して疎水性部位が膜内
に侵入し，内封物を漏出させることができる
孔を形成することが確認された。
3-3CD スペクトル測定による二次構造の確認
CD スペクトル測定の結果より LP はいずれ
120
Fluoresccent Intensity (%)
3 結果および考察
3-1 ペプチドの設計および合成
LPは緒言に記した通りMelittinのC末端側の
塩基性アミノ酸を含む配列を保存し，膜透過に
寄与する部位をロイシンとアラニンの交互配
列に単純化した。しかし，pHによる膜透過活
性の制御が期待できないため，LPの配列を基
本としてエンドソーム環境におけるpH応答性
を考慮したLPH，LPE3，LPE5の設計および合
成も行った。
LPHはLPの塩基性アミノ酸であるリシンと
アルギニンを全てヒスチジンに置換したもの
である。ヒスチジン側鎖のイミダゾール基の酸
解離定数は6.0付近であり，中性付近(pH 7.4)で
は正電荷を有さないため，リポソーム表層と静
電相互作用を示さないことが予想される。一方，
エンドソームpH(= 5.0)ではイミダゾール基は
プロトン化により正電荷を有することが予想
され，リポソーム表層と静電相互作用し膜界面
に接近し，膜透過の引き金となることができる
設計とした。
また，LPE3 および LPE5 は膜透過に寄与す
る疎水性部位を形成する 3 および 5 箇所のロ
イシン残基をそれぞれグルタミン酸に置換し
たペプチドである。グルタミン酸は中性付近
では側鎖が解離して負電荷を有するためペプ
チドの疎水性領域が親水的になり膜透過が達
成できないことが予想されるが，エンドソー
ム pH ではグルタミン酸側鎖の解離が抑えら
れるため，疎水性を保持できることから膜透
過が達成できるよう設計した。
の pH 条件下においても 208 nm と 222 nm 付
近に負の極大が観測された。このシグナルは
α ヘリックス構造の形成を示すものであり，
LP が膜内に侵入する際に α ヘリックス構造
を形成していることがわかった(Figure 2)。
100
80
Triton X-100
60
LP
40
pH 7.4
pH 5.0
20
0
0
5
10
15
20
25
30
Time (min)
Figure 1 Kinetics of calcein leakage from
liposomes at pH 7.4 and pH 5.0 when 20 M of
the lytic peptide (LP) were added to the system at
30 ℃.
10
【θ】 ×103 (deg・cm2 / dmol)
ペプチド濃度は蛍光測定と同様に 20 M とし，
測定波長 200 nm ~ 240 nm，積算回数 10 回で
測定を行った。
8
6
pH 7.4
4
pH 5.0
2
0
-2
-4
-6
-8
200
210
220
230
240
Wavelength (nm)
Figure 2 CD spectra of 20 M of the lytic peptide
(LP) were added in the presence of liposomes at
pH 7.4 and pH 5.0.
4 結言
実験結果より Melittin のロイシンとアラニ
ンの繰り返し配列による疎水領域改変は有効
であることが確認された。また LPH と LPE3，
LPE5 に関しても LP と同様の測定を行いリポ
ソームに対する親和性を評価した。これらの
詳細な結果については更なる検討中であり本
講演にて発表を行う。
[参考文献]
1) T. C. Terwilliger , D. Eisenberg , J. Biol.
Chem. 1982, 257:6016-6022.
2) H. Vogel , F. Jahnig Biophys J. 1986, 50:
573–582.
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