1. No category

北海道草地研究会報 2
7:63-66(993)
防r
t
i
c
i
l
l
i
u
ma
l
b
o-atrum菌体細胞壁成分に
対して高いペルオキシダーゼ活性を示す
アルフアルファ細胞系統の誘導と選抜
勝又亨祥・小池正徳・嶋田
徹(帯広畜大)
I
n
d
u
c
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n and s
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no
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g
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c & Vet
.M
e
d
.
)
緒
材料及び方法
1
=
1
1.供試植物
ペルオキシダーゼ (P0) は、病害抵抗性反応
でのスベリン化、リグニン化に深く関与する酵素
Medicagos
a
t
i
v
a L. )
アルフアルファ (
。最近、 J
o
n
e
sは、この
のパーティシリウム萎ちょう病感受性個体 V6
として知られている
I-5)
6
(品種パータス)を用いた。
ような植物の動的抵抗性反応(過敏感細胞死、フ
ェニルアラニンアンモニアリアーゼ (PAL) 活
2
. 組織培養
性、ファイ卜アレキシンの蓄積など)を選抜マー
5分
培養細胞は、 V6の未展開葉を切除し、 1
カーとして利用した新しい細胞選抜法の可能性を
間
、 5%次亜塩素ナトリウムで表面殺菌し、殺菌
論じた。また、
水で、 3回洗浄後、 SH寒天培地
Koike と Shimada は、
7
)
防げた i
l
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m a
l
b
o-atrum 細 胞 壁 成 分 を
2mg/mlカイネチン
V
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r
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i
c
i
l
l
i
u
m萎ちょう病の抵抗性程度の異なる遺
2mg/ml、寒天
(2， 4-D
2mg/m，
1 NAA
0.8%)上に置床し、暗
伝子型の細胞系に処理した場合、抵抗性の細胞系
所2
5:
1
:1o
Cで誘導した。
において特異的に POと PAL活性が増加したと
誘導したカルスを SH液体培地に移植し、懸濁細
報告し、これらの酵素活性が細胞選抜のマーカー
4日ごとに新鮮 SH液体培
胞を作出した。以後、 1
形質として利用できることを示唆した。
地に移植し、継代培養した。
3
. 突然変異処理
そこで、今回はアルフアルファ・パーティシリ
3--5回継代培養した増殖のよい懸濁細胞に
V
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u
m a
l
b
o
ウム萎ちょう病菌 (
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t
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u
m
) の細胞壁成分 (VaaCWC)処理後、
N' ーニトロソグア
突然変異誘発剤 N-メチル -
高い PO活性を示すアルプアルファ培養細胞系統
ニシン (MNNG) を 10μg/ m1， 20μg/
を、選抜することを目的とした。
0分間 3
00C 6
0rpmで・処理し、
mlの濃度で、 3
その後、新鮮 SH液体培地で 3回洗浄後、 SH寒
5:
1
:1o
Cで培養
天培地にプレーテイングし、暗所2
した。対照区として、殺菌水で-同様の処理を施し
ο
q
J
. Hokkaido G
rassl
.S
c
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.2
7:63-66 (
19
9
3
)
f
こ
。
た。このうち、 MNNG無処理系統は、ランダム
4
. 細胞系統の維持
2
0細胞系統を選びだし、 MNNG処理系統は
に1
突然変異処理後、出現した 1細胞コロニーを
4
0細胞系統を作出した。この 2
6
0細胞
生存した 1
1培養細胞系統とし、 4週間ごとに継代培養を繰
系統のうち、増殖のよい 6
5細胞系統 (MNNG無
り返し、各細胞系統を増殖させた。
9系統、処理3
6系統)を予備選抜し、 PO活
処理2
5
. VaaCWCの抽出と VaaCWC処理
性測定に用いた。
VaaCWCの抽出は、 V
.a
l
b
o-a
t
r
u
m菌
図 1に6
5細胞系統の水処理4
8時間後の PO活性
i
a
t
t
iらの方法 8) を修正し行った 9) 。
体から B
値と、 VaaCWC処理4
8時間後の PO活性値の
VaaCWC処理は、 7日間 SH寒天培地上に置
頻度分布を示した。水処理後の PO活性値の最大
床した約 3
0
0m gの培養細胞に、 VaaCWC
値は 2
1
.0
であり、 VaaCWC処理後の最大値は
(グルコース当量
100μg/m1
) を30μl処
4
5
.3であった。また、 6
5細胞系統の水処理後の
0
理し、 2
0C暗所で維持した。対照として、同量の
PO平均活性値3
.
9
7， VaaCW C処理後では 6
.
殺菌水を処理した。
1
0で あ っ た 。 ( ム 470/m g タ ン パ ク /
6
. P0活性測定と選抜評価
m in)
VaaCWC処 理4
8時間後の培養細胞系統
を
、 50mM
Tris-HC 1緩衝液
(pH =
1
0
8
.
8
) でモジネートし、その後、遠心分離(12，
系
0
0
0rpm、 3分間)行い、上澄み液を粗酵素液
統
とした。
数
粗酵素液 100μlを酵素活性測定試薬 3ml
(50mM T ris-HC 1， 5m M
5
0 -メト
1
0
キシフェノール、 5mMH202) 中に加え、 4
7
0
1
5
2
0
nml分間の吸光度の変化を分光光度計で測定し
f
こo
系
らの方法により測定した 10) 。
r
o
d叶
パク mg) で示し、 PO比活性は (VaaCWC
処理後の PO活性値/水処理後の PO活性値)で
示した。
1
0
1
5
ペルオキシダーゼ沼ー佐 (sA470・1Ir; p
r
o
t
e
i
n
' ・.
i
n
')
図1
. 6
5細胞系統ペルオキシダーゼ活性頻度
分布図
図 2に6
5細胞系統の PO比活性値の頻度分布を
また、各培養細胞系統の PO活性測定は、 3
反復の平均で求め、選抜はレプリ力法を用いた。
β
盟
主
PO活 性 値 は (1分間の吸光度の変化/タン
⋮
⋮
粗酵素液中のタンパク質含量は、 Lowry
.4
6、最大値は 1
0
.
示した。比活性値の最小値は O
4
9を示し、幅広い変異が確認された。平均比活性
結果及び考察
突然変異処理後、 2
6
0培養細胞系統を作出し
3で、親株 V6比活性値O
.7
9に比べ 2
.
2倍
値は1.7
高い平均比活性値を示した。
4
北海道草地研究会報 2
7:63-66(993)
V6
ヲ
Z
であれば、 VaaCWC処理後の PO活性を選抜
.
B7 9 E
2.
目
20
マーカーとした、パーティシリウム萎ちょう病抵
抗性細胞の選抜に有効な手段のーっとなりうるだ
15
妥
ミ
ろう。また今回は、可溶性 PO活性のみしか測定
主
f
f
. 10
を行わなかったが、動的抵抗性反応において、可
喪支
溶性 POだけでなく、イオン結合性 POや膜結合
5
。
。
性 PO活性の増加も認められるため 1-5、12- 16) 、
土乞
図2
.
5
2.5
古雪
10
これら結合性 POについての解析も検討して行き
i
i
I
l
ぞ主
PQ比活性頻度分布
たい。
これらの 6
5細胞系統から、まず 2
.5以上の PO
比活性値を示す 1
6細胞系統を選抜した。次にこれ
らの細胞系統から、更に VaaCWC処理後安定
Summarγ
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して高い PO活性を示す 4細胞系統 (
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37-V 6) を選抜した(表 1)。この 4細胞系統
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apathogen(防r
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の比活性値は、親株 V6の 2
.7倍，_4
.6倍の値を
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示した。
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n
g method was c
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5c
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l
表1
. 4細胞系統の平均比活性値
細 胞 系 統
一
、
，
.6
止
む
詫E
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e genotype
2 0ーマ - 4 6 - V 6
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10-35-V6
3. 6 4
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10-37-V6
2.
10
o.
79
20-7-36
V 6 (親容量〉
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gp
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.
突然変異誘発剤 MNNGの効果は、全体の細胞
引用文献
数 (
6
5系統)は少ないが、得られた 4細胞系統は
1
)M
i
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lH
.
W
a
l
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r (992) I
n "Genes
全て MNNG処理系統であることから.、有効に作
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di
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f
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n
c
e"pp3
2
6-3
4
6
2) Vidhyasekaran. p， (1988) I
n
用したものと考えられる。
すでに我々は VaaCWC処理後、高い PAL
P
h
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s
i
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s
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a
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e R
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i
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n
活性を示す培養細胞系統を選抜し、 i
nv
i
t
r
oで・病
P
l
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n
t
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o
l 1 "pp121-135; Boca
原菌に対して抵抗性反応を示すことを明らかにし
Raton CRC
た 11) 。今後、今回得られた高い PO活性を示す
3) Vidhyasekaran. P， (1988) I
n
4培養細胞系統の、菌分生胞子処理後の過敏感細
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h
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n
胞死などの種々の病害抵抗性反応をさらに検討
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l
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o
l 2"pp5-16;Boca Raton
し、もし、この 4細胞系統が抵抗性反応を示すの
CRC
- 6
5ー
J
. Hokkaido Grassl
. Sci
.2
7，: 6
3-6
6(
19
9
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19
8
6
) Protoplasma，1
3
2
;1-11
1
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5-2
7
5
5) Mohan. R，P
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-82