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産総研 新技術説明会 (ライフサイエンス)
光を用いた細胞操作技術
独立行政法人産業技術総合研究所
幹細胞工学研究センター
医薬品アッセイデバイスチーム
金森 敏幸
2014年2月21日
JST東京本部
技術開発の背景
2
Melvin Henriksen
Nature Methods 7, (2010)
doi:10.1038/nmeth.f.302
Image CytometryからImaging Cell Sorting (ICS)へ
Imaging cytometryの普及により、見てい
る（in situで）細胞を生きたまま回収する技
術（imaging cell sorting）が必要となった。
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ICSの優位性
オンプレート細胞培養
 体細胞の大部分は足場依存性（接着性）
 伸展状態の細胞の観察には好都合
細胞を分別するには・・・
本技術
光照射
既存技術
剥離回収
分離
基材からの強制剥離
さっき見てた細胞はどこ？
ノズルからの吐出
（FACS）
4
再播種
制御手段としての光
局所 µmスケールの制御
遠隔 透明な材料の利用が可能
即時 瞬時にon/offが可能
 豊富で安価なIT機器が利用可能
 PCとの相性が良い
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pH、温度、光に応答する高分子を開発
x : y : z = 1 : 99 : 1 - 33
Thermoresponsive
Photo- &
pH-responsive
O
O
O
Photo-responsive
m
S
N
+H+
SH
O
O
OH
+N
ｈv, Δ
y
MH
z
N
O
+N
Ｍ
Basic
+
-H+
OH
+N
O
O
O
+
HN
Δ
HN
NH
irrad.
Δ
ｈv
O
NH
x
n
O
-H+
Acidic
O
NH
+H+
+
λ max＝530nm
irrad.
λ max＝422nm
 数十種類のラインナップ
 用途により使い分け
Sumaru T., et al.: Langmuir, 22, 4353 (2006)
Satoh T., et al.: Soft Mater., 7，8030 (2011)
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In situ光照射装置も独自開発
microscopic
image
CCD
unit
irradiating
light
projection
unit
projection image
7
2次元ICS
8
光細胞マニピュレーションのバリエーション
細胞接着領域作製
1
接着細胞回収
光応答性結合
細胞接着阻害物質
2
光照射
3
4
5
光照射
6
9
接着細胞殺傷
光細胞マニピュレーションの一例
精密共培養
細胞殺傷
照射前
標的細胞
（黄色：生細胞）
他の細胞
（緑：生細胞）
照射後
標的細胞
（赤：死細胞）
MDCK
CHO-K1
MDCK
照射中
照射領域
細胞回収
HepG2, 436nm, 250mW/cm2
2 min
(30 J/cm2）
3 min
(45 J/cm2）
Kikuchi K., et al.: Biotech.Bioeng., 103, 552 (2009)
Sumaru K., et al.: Biotech.Bioeng., 110, 348 (2013)
10
精密共培養の効果
Patterned co-culture on day20
10
X6.7
X3.7
x3.5
5
HepG2
Monolayer
CYP1A2
HepG2/3T3
Co-culture
CYP3A4
HepG2
Monolayer
Glass plate
HepG2/3T3
Co-culture
HepG2 spheroid
HepG2
Monolayer
HepG2/3T3
Co-culture
3T3
Albumin
Kikuchi K., et al.: Biotech.Bioeng., 103, 552 (2009)
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光によるhiPS細胞コロニーの殺傷・選抜
光照射前
hiPSCコロニー
光照射 (１分程度)
緑：CalceinAM
赤：AiLec-S1
光照射・ピペット洗浄後
ピペット洗浄後
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３次元ICS
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活性エステル型光分解性架橋剤
NHS-PC-4armPEG
水中・常温にてアミノ基に結合
Amino-4armPEG
Gelatin
+
+
NHS-PC-4armPEG
NHS-PC-4armPEG
Mixing of
two components
Crosslinking
光により分解
Light irradiation
hn
+
14
Degradation
光照射によるゲル表面での構造形成
500 μm
500 μm
500 μm
500 μm
ゲルの組成：
5 mM amino-4armPEG
5 mM NHS-PC-4armPEG
ゲルの組成：
2.5% w/v gelatin
5 mM NHS-PC-4armPEG
光照射条件：365 nm, 30 mW/cm2, 300 sec
Yanagawa et al.: submitted to Chem. Mater.
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光照射条件と得られる構造 (Amino 4arm PEG)
Bars=800μm
Bars=400μm
Yanagawa et al.: submitted to Chem. Mater.
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光分解性ゲルを用いた3次元培養下での細胞選抜
モデル細胞播種
悪性細胞伸展
悪性細胞に光照射
細胞をピペットで回収後、
ディッシュにて1週間培養
田村, 他: 第65回日本生物工学会大会において発表
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実用化に向けて
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想定される用途
共培養による臓器特異的機能発現
細胞間相互作用の分子生物学的研究
例えば、医薬品候補化合物の細胞アッセイ技術
臓器・組織
例えば、理化学機器
リード化合物
O O
O N
H
O
 細胞選抜
 灌流培養
 精密共培養
 アッセイ
O O
OH
O
分散・懸濁
培養, 分析 ・・・・
アレイチップ
株化細胞
特定の細胞の回収
自動アッセイ装置
培養下での細胞選抜
例えば、がん細胞診断技術
三次元培養＆形態解析
光照射による細胞選抜
浸潤性細胞
生検組織
光分解性架橋剤
抗がん剤
非感受性細胞
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共同研究先募集
共同研究実績
企業様と29件の共同研究を実施
企業様と共同での外部資金の獲得多数
知的財産
紹介技術について、3件の特許を権利化、1件公開中、3件出願済み
外国（PCT）出願も実施(一部権利化済み)
問合せ先
独立行政法人産業技術総合研究所
幹細胞工学研究センター
医薬品アッセイデバイスチーム
研究チーム長 金森敏幸
E-mail：[email protected]
Tel：029-861-6286
20
お問い合わせ先
産業技術総合研究所
ライフサイエンス分野研究企画室
TEL : 029-862-6032
FAX : 029-862-6048
e-mail : [email protected]
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