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SURE: Shizuoka University REpository
http://ir.lib.shizuoka.ac.jp/
Title
Author(s)
キノコに由来する生物活性物質の化学的研究
伏見, 圭司
Citation
Issue Date
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Version
2012-01
http://hdl.handle.net/10297/7480
ETD
Rights
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静岡大学 博士論文
キノコに由来す る生物活性物 質 の化学的研究
2012年
1月
大学院 自然科 学系教育部
バイオサイエ ンス専攻
伏
見
圭
司
Chemical studies on biologically active compounds from
mushrooms
Keiji Fushimi
Department of Bioscience
Graduate School of Science and Technology
Shizuoka University
目次
第
1部
フミヅキタケ ●gFaリ レ′″
α
′
ι
の に由来す る植物成長調節物質 の探索
第 1章
緒論
2
第 2章
本論
6
第 3章
第
2部
第 1節
フミヅキタケ由来 の植物成長調節物質の単離・ 精製
6
第 2節
フミヅキタケ由来 の植物成長調節物質 の構造解析
9
第 3節
植物成長調節活性試験
48
第 4節
フミヅキタケ由来の植物成長調節物質 の合成
51
第 5節
考察
53
実験部
56
第 1節
使用器具および材料
56
第 2節
フミヅキタケ由来 の植物成長調節物質 の単離・ 精製
58
第 3節
X線 結晶構造解析
第 4節
植物成長調節活性試験
61
第 5節
フミヅキタケ由来 の植物成長調節物質 の合成
62
コフキサル ノコシカケ
60
6“ οル脇 α″口
細菌活性物質 の探索
第 1章
緒論
第 2章
本論
第 3章
α″
由来す る抗 口腔内
“ ")に
67
69
第 1節
コフキサルノコシカケ由来の抗 口腔内細菌活性物質 の単離・ 精製
第 2節
コフキサルノコシカケ 由来 の抗 口腔内細菌活性物質 の構造解析
第 3節
抗 口腔内細菌活性試験
第 4節
考察
実験部
第 1節
使用器具および材料
第 2節
抗 口腔内細菌活性物質の単離・精製
第 3節
抗 口腔内細菌活性試験
lo4
lo5
lo7
lo7
lo9
Hl
69
71
論 文要 旨
112
Sumlnary
H5
７ ５
謝辞
Ｈ ２
︲
参考 文 献
第
1部
フミヅキタケ Иgrοりιθ′ ι → に 由来す る
““
植物成長調節物質 の探索
第
1章
緒論
2007年 、新潟県 のある ビニールハウスにおいて、通常よ りも肥大 したイチ ゴ
電 αttα
X
『 う現象が確
αα″
α
∬αDuchesne)の 実が現れ、その後、根元 の土壌か らキノコが発生するとい
“
認された。このキノコを同定 したところ、フミヅキタケ graッ bι ′″θ
ε
鋸)で ある ことが明
らか となった。一方 、フミヅキタケ属 の菌 はイチ ゴのす“
くみ症状を引き起 こす病原菌 とし
ても報告 されている
1。
これ らの対照的な現象は、 この菌が植物ホル モンの様な生理活性 を
示す植物成長調節物質 を産生 していることを示唆 している
(Fig。 1)。
promotion
inhibition
Fig.1.:nteraction beh″ een Д.praecoχ and strawberry in a greenhouse.
(A)ln a greenhouse in Nligata prefecture,Japan,soil cutture of strawberry fruls.(B)Growth
slmulalon and suppression toward strawberry fruls byハ
groc/be genus.
そ こで 、上記 の ビニールハ ウスか ら単離 した 菌株 を培養 し、菌糸体 と培養 ろ液 に分離 し
て イチ ゴに対す る影響 を観察 した。 土耕栽培 の イチ ゴに対 しては菌糸体 の処理 を行 い、水
耕栽培 のイチ ゴの成長 に対 しては培養 ろ液 の処理 を行 った。その結果、土耕栽培では植物
体 の成長促進が観察 された 。さらに、そ の後 、根元 の土壌か ら子実体 の発生が観察 され た。
また、菌糸体 の植物体 へ の侵入 は観察 され ず、土壌 へ の拡散 が観察 された 。水耕 栽培 では
植物体 の成長阻害が観察 された
(Fig。 2)。
これ らの観察 によ り、 フミヅキタケ の菌糸体 の体
内で 産生 された植物成長調節物質が体外 に放 出 され 、イチ ゴの成長 に対 して影 響 を与 えて
い る可能性が ある ことを確認 した。
イチ ゴはバ ラ科 の植物であ り、世界 中で栽培 されて い る重 要 な作 物 の 1つ である。 さ ら
，
“
B
treatrnent
Fig.2.Effect of Д.praecoχ on the gronh Of strawberry.
(A)Effect ofス .ρ raecoχ on the gЮ wth of strawberry in soii cuLure.Atter 5 months Of the
inoculation of the mycelia, the leaves of the fungus‐
infected plant grew bigger than the
control,and atter 1 0 rnonths the fruiting bodies Ofthe fungus appeared at the plant's base.
(B)EfFect ofス
.ρ raecoχ
on the growth of strawberry in water cutture.After 5 months Of the
inocuiation of the culture broth,the ieaves of the fungus¨
afFected plant was dwarfed and
altered in colon
に、バ ラ科 の植物 の 中で もゲ ノムが 小 さい、 繁殖周期 が短 い、容易 に植物体 が 発生す ると
い う特徴 をもつ ことか ら、生物的 (昆 虫
2‐ 6、
度
18,19)ス
菌類
7‐
11)、
非 生物的 (農 薬
り'13、
温度
トレス に対 して 耐性 をもつ遺伝子組換 え体 の研究 がな されて い る
20。
И17、
塩濃
また、灰色
gα ′
αε
z″ 勉 ,Cル α
′
αθ等 )は イチ ゴ
“
heX‐ 2… ena123-25、 triterpenes
ィ チ ゴ は o⊃ ―
カ ビ病菌 cο ヵ
おθ
′
″θ
″α)や 炭疸病菌 (OJJaわ ″た乃
γ′
"“
に 重 篤 な被 害 を 与 え る植 物病 原 菌 で あ るが
(euSCaphic acid,myrianthic acid,torlnentic acid)26、
20-22、
prOanthocyanidins27,28等 の二 次代謝産 物 を生
合成す る ことで これ らの病原菌 に対 して 防御反応 を起 こす
(Fig。 3)29。
フミヅキタケは主 として 北部温帯 に広 く生息 して い る食用 の キ ノコである。 この キ ノコ
は森林 中 の土壌 に生 息す る リター 分解菌で あ り、非特異的 に酵素 を産生 して 細胞外 に分泌
す る ことで土 壌 に堆積 した葉や枝 を分解 して い る30。 そ の分解物は土壌微生物や植 物 に利用
Myranthic ao!d
Euscaphic acld
/｀
/｀
(o‐ Hex
イ
ヘ
Tormentic acid
。
2 enal
Proanthooyanldh
Proanthooyanidin
F:g.3.Chemical structures of phytoaiexins and an■ funga:s from strawberry.
され るため、土 壌 中 の物質循環 にお いて 重要な機能 を して いる。 また、 この菌種 の生 態や
産生す る加 水分解酵素
素
caccaSC、
mangancse peroxidase等
31‐ 39。
期待 されて いる
glllcosidase、
β‐
(∝ gluCOSidase、
CCllolDiosidase等
β‐
)、
リグニ ン分解 酵
)の 酵素活性 はパイオ レメデ ィエー シ ョンヘ の応用 に
しか し、フミヅキタケ と植物 の相 互 作用 による共存関係 につ いて化学
的研 究 はされていな い。
近年、植物ホルモンとして認知 されている auxhs40,4、 まbbCrclHns42,43、
abSCisic acid“ '45、
jasmonic acid46,47は それぞれの基質 と受容体 との作用機序が解明 された。さらに、植物 と菌
類 の相互作用 に関与する植物成長調節物質 として sttgolactones48,49ゃ
2‐ azahypoxanthin950、
hidazolc‐ 4-carboxyamidc'が 発見 された cig 4)。
Auxln
Abscisic aold
Gibbere‖ in
‖
れ》
Strlgolactone
2-Azahypoxar{hine
」asmonic acid
甲
牝》
lmidazole-4carboxyamide
Fig. 4. Chemical structures of plant hormones and plant growth regulators.
‐4‐
この様な植物成長調節物質 の発見やそ の作用機序 の化学的解明は農業面の応用 に対 して
非常に有効である。以上よ り、本研究では、フミヅキタケに由来す る植物成長調節物質 の
単離・ 精製および構造解析 を目的 とした。
‐5‐
第
1節
第
2章
本論
フ ミヅキ タ ケ 由来 の 植 物 成 長 調 節 物 質 の 単 離 ・ 精 製
フミヅキタケの種菌 をポテ トデキス トロース液体培地 に移植 して
3週 間培養を行 った。
そ の後、遠心分離、ろ過によって菌糸体 と培養ろ液 に分離 した。菌糸体は凍結乾燥後破砕
ヘキサ ン、酢酸 エチル、エ タノール、水で順次浸漬抽出 を行 い、4-ヘ キサ ン可溶部、
…
し、″
酢酸 エチル 可溶部、エ タノール可溶部、水可溶部を得た。培養ろ液は減圧濃縮後、酢酸エ
チル、″‐
ブタノールで順次分配抽出を行 い、酢酸エチル可溶部、ルブタノール可溶部、水可
溶部を得た。植物成長調節活性試験 を行 うにあた り、イチ ゴを材料 として使用するのには
十分な培養期間とサ ンプル量が必要 となるため、よ り簡便 に調製する ことができるレタス
を材料 として使用 した。得 られた各画分 について レタスに対する植物成長調節活性試験を
行 ったところ、菌糸体 のエ タノール可溶部 および培養ろ液 の酢酸 エチル可溶部 に顕著な レ
タスの伸長抑制活性が確認された
I
root
EtOH
H20
from the mycelia (1 mg/ml)
hypocotyl,
I
root
n‐ BuOH
EtOAc
n-hexane
Fig.5.Effect of each fraction from
I
。 。 ０ 。 。 “ 。 。
４ ２ ０ ８ ６
２
hypocotyl,
舎ｏ﹂︺
Ｅｏｏい
ｏ Ｓ︶ｏｔ ﹄Ｅ Ｅ ｏ﹂０
０ 。 。 ０ 。
０ ０
４ ２ ０ ８ ６ “ ２
一０お〓Ｏｏ一
０ ゞ︺ф罵 ﹄ＥＥ Ｏ﹂０
I
(Fig。 5)。
H20
from the culture broth (1 mg/mL)
Д,praecoχ on the growth oflettuce.
Lettuce seedlings were treated with extracted fractions fЮ m the mycelia(le■ )and the cuttu¨
re broth(‖ ght)(l mg/mL).丁 he lengths ofthe hypocotyl and the
Юot were measured using a
ruiero ResuLs are the rate of growth iength compared with control±
彙
0.05,・ Pく
standard devialon(・ Pく
0.01 vs control,n=7).
そ こで、 この活性試験 の結果 を指標 に しなが ら各種 ク ロマ トグ ラフィー による分画 を行
った。 培養 ろ液 の酢酸 エ チル可 溶部 をシ リカゲル の フラ ッシュカ ラム ク ロマ トグラフ ィー
によ り
3¨
12画 分 に分画 した。画分 3は 順相 HPLCに よ り 7画 分 に分画 し、さ らに、画分
6か ら逆 相 HPLCに よって化合物 7を 単離 した。 画分 4は 順相 HPLCに よ り 9画 分
‐6‐
に分画 し、さ らに、画分 4-5か ら逆 相
HPLCに よって化合物 1-4,6を それぞれ 単離 した。
5は 順相 HPLCに よ り 8画 分 に分画 し、 さらに、画分 5-5,5-6は 逆相 HPLCに よ
りそれぞ れ 7画 分 に分画 した。さらに、画分
6,5… 6か ら逆相 HPLCに よって化合物
画分
5… 5…
2,5を それぞれ単離 した
6‐
(Fig。 6)。
「…彎
A″
praecoχ
d filtrated
Cu:ture broth(175L}
F:∬
∬ま::￨:憲I:11∬ ]ti
EtOAc soluble pdrt
1rs.a o)
Flash C.C.(s‖ iCa ge1 60 N)
CH2C12ノ EtOAc=100′ 0,90/10,80ノ 20,
70/30,60/40,50/50,
巨tOAcノ
6
NP‐ HPLC{SenShu
NP‐ HPLC(SenShu
F7‐
77‐
1e.o
fI
MeOH=100/0,50/50,0/100
PAK AQ)
heXane/CHC13=20/80,0ノ 100
ms1
7
1
5
ne-xer-c (cosuostL rNApwaters)
MeOH/H2O=40/60, 100/0
(zo.o
l-
ms)
I
ne-xer-c (cosmoslL rNAp waters)
I
I
PAK AQ)
heXane/CHC13=20/80,0/100
MeOH
lH2a=40/60, 10010
I
compound 7 (z.r mg)
compound 1 (s.o,r,sl
compound 2 ro.z ms)
COmpOUnd 3 (r.r ,ng)
COmpoUnd 4 (z.z rnq)
compound 6 (o.e msl
NP‐ HPLC(SenShu
F7‐
5
PAK AQ)
hexane/CHC13=20/80,0′ 100
6
(sz.g mg)
(zs.o ms)
RP‐ HPLC
iCOSMOSiL πNAPwaters)
MeOHノ H20=40/601100ノ 0
1
6(1.3mg) 7
f- ne-xeuc (cosMostL opyE waters)
I rueoH / H2o = 40 / 60, 100 / o
I
compOUnd 2
RP‐ HPLC(COSMOS:L
1
6
1r.s
f-
I
ms1
I
Fig. 6. Purification procedure of culture broth of A. praecox.
‐7‐
7
ne-Her-c (cosMostL spyEwaters)
MeOH/H2O=40/60, 100i 0
compound 5 (t.s mgl
(o.o,ns)
πNAP waters)
McOHノ H20=40′ 60,100/0
また、画分
使用 した
4…
Fraction 4・ 5
1.0
―
0
0.6
03 0.5
く
6・
6
Fraction
55{
1.6g
菫■■
0.7
●
(Fig。 7)。
X250 mm
奎菫理爾
︵
Ｐ
〓Ｃ︶
ゞ″
〓ち〓０■
●≫
＞
08
5は 、UV‐ vls多 波長検 出器 を
10.5 mL/min
- Fraction 5‐
０
０
０６
０４
０ｍ０
０
４２
８
３
３櫛２
２２
２
0.9
馬
●
πNAP waters i 4.6゛
Solvent i MettH/H20=40/60
Detect i UV=260 nm
1.1
1¨
HPLC分 析 によって特徴的な UVス ペ ク トル パ ター ンが観測 された
Column i cosMoslL
1.2
⊃
二
5お よび画分 5-6-6か ら単 離 した化合物
0.4
0.3
02
0.1
0.0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Retention time(min)
Fig.7.HPLC analysis offractions 4‐ 5 and 5口 6‐ 6.
Fraclons 4… 5 and 5¨ 6‐ 6
were analyzed by HPLC(column,cOSMOSIL
πNAP VVaters,20 φX
250 mm;solvent,MeOH/H2040:60,0.5 mL/min;detect,UV=260 nm)and COmpounds l‐
4
and 5 were detected,respect市 ely.Compound l:tR=41.5 min;UV(λ max),200,218,233,
247,261,276 nm.Compound 2:tR=45.6 min;UV(λ max),250 nmo Compound 3:tR=34.2
min;UV(λ max),220,271,287,306 nmo Compound 4:tR=36.6 min;∪ V(λ max),218,271,287,
306 nm.Compound 5:tR=38.O rnin;UV(λ max),200,215,232,246,260,276 nm.
‐8‐
第
2節
フ ミヅキ タ ケ 由来 の 植 物 成 長 調 節 物 質 の 構 造解 析
フミヅキタケの培養ろ液 の酢酸 エチル可溶部 か ら単離 した各化合物 について、各種機器
分析による構造解析 を行 った。
2‐
2-1化 合 物 1の 構 造 解 析
化合物
1は 無色針状結晶 として単離 された。HR‐ ESIMSに お いて
"z158.0559[M+Na]+
(CalCd fOr c8H9NNaO,158.0582)の 分子イオ ンピー クが観測 され、分子式を C8H9NO、 不飽和
度を
5と 決 定 し た
(Fig。 9)。
Rに
ぞ れ 吸 収 ピー ク が 観 測 さ れ た
ルが
お い て 1652(C=0)、 2244(C≡ C)、
(Fig。 10)。
lH―
NMR、
13c_NMR、
DEPT、
3136 cm l oH2)に そ れ
HMQCに
1つ 、メチ レンが 2つ 、4級 炭素 が 5つ 存在す る ことが明 らか になった
Table l)。
よ り、 メ チ
(Figo H-14,
これ らの ことか ら、2つ の三 重 結合 とアミ ドの存在 が 示唆 された。COSYの 相関
(H7/H6,H8)お よび
部分構造 を決定 した
学 シフ トの値
16,Table l)。
(δ
HMBCの 相 関
(Fig。
(H6/C7,C8;H7/C6,C8;H8/C6,C7)に よ り、プ ロ ピルの
HMBCの 相関
8,15,16)。 さらに、
(H6/C2to C5;H7/C5)お よび化
c 63.7,67.0,71.7,87.3)に よ り、ブタジイ ンの部分構造 を決定 した
以 上 によ り、化合物
1を
octa… 2,4…
構造解析 によ り、化合物
1の 構造 を決定 した
agrocybyne Aと 命名 した
(Fig。 18)。
Fig.8.COSY and HMBC correlations in l.
‐9‐
(Fig。
8,
diynamideと 推定 した。 さ らに、X線 結 晶
(Fig。
17)。
化合物
1は 新規化合物であ り、
Fig.9. ESIMS (+) spectrum of
1.
６ ０
０ ０
l
80
3136 cm■
(NH2)
%T
￨
2244 om‐ 1
lCttC)
l
1652● mJ
(C=0)
50
4000
3000
2000
Wavenumberlcm■
F:g.lo.IR spectrum of l.
‐10‐
1000
1
400
Fig, 11. rH NMR spectrum of { (in CDCI3).
Fig, '12, 1sC NMR spectrum of
I
(in CDCI3).
Flg. 13. DEPT Epectrum of 1 (in CDCIg).
Fig.14.HMQC spectrurrl of l(in CDCi3)・
6
7
￨
｀
◇
Fig. 15. COSYspectrum of 1 (in CDCI3).
“０
，
‐
劇
F
●
じｒ ト
1
９ “
8
6,7
４ ２ ３ ５
一
´
一 Fig. 16. HMBC spectrum of
I
(in CDCI3).
Fig. 17. ORTEP drawing of 1.
‐13‐
Table
l.
1H
and r3C NMR data for 1 (in CDCI3),
Ｃ δ
lH
δ(muLip‖ city,」 in Hzl
HMBC
lH t。
13c
153.5
67.04
71.74
63.74
87.3
230(t,7o
157(m)
213b
2,3,4,5,6,7,8
21 .4b
5,6,8
099(t,73)
13.4
6,7
"'o Interchangeabie between the sarne lettetl
Fig, 18. Agrocybyne A (1).
14‐
2‐
2-2化 合物 2の 構造解 析
化合物
2は 無 色 針 状 結 晶 と し て 単 離 さ れ た 。 HR― ESIMSに
0731[MttNa]十
お いて
"z160。
(CalCd fOr c8HllNNaO,160.0738)の 分 子 イ オ ン ピ ー ク が 観 測 さ れ 、 分 子 式 を C8HllNO、 不 飽
和度 を
4と
決 定 した
(Fig。 20)。
IRに お い て
そ れ ぞ れ 吸 収 ピー ク が 観 測 され た
メチル が
21)。
lH‐
l oH2)に
NMR、 13c_NMR、 DEPT、 HMQCに
よ り、
1つ 、 メチ レンが 2つ 、 メチ ンが 2つ 、 4級 炭 素が 3つ 存 在 す る ことが 明 ら
か に な った
の
(Fig。
1652(C=0)、 2197(C≡ C)、 3136 cm‐
(Fig。
22-25,Table 2)。 各種 ス ペ ク トル デ ー タ の 比較 によ り、化 合物
2は 化 合物
1
1つ の 三 重 結 合 が 二 重 結 合 にな っ た 類 縁 体 で あ る こ とが 示 唆 され た 。 COsYの 相 関
(H7/H6,H8)お よび
部分構 造 を決定 した
HMBCの
(Fig。
相 関 (H6/C7,C8;H7/C6,C8;H8/C6,C7)に よ り、 プ ロ ピル の
19,26,27)。
さ らに、COSYの 相 関 (H5/H4,H6)、
HMBCの
相関
(H4/C2,C6;H5/C3,C6,C7;H6/C4,C5;H7/C5)0お よび δH 5.52(lH,d,」 =16。 2 Hz,H4)の 結合
エ ンイ ンの 部 分構 造 を決定 した
定 数 によ り、o… ブ トー
化 合物
2を
(Fig。
(o― oct-4… en-2-ynamideと 決定 した。化 合物
Bと 命 名 した
(Fig。 28)。
Ｙ
Ｓ
一
Ｏ
Ｃ
Fig.19.CosY and HMBC correiations in 2.
‐15‐
19,26,27,Table 2)。 以 上 によ り、
2は 新規 化 合物 で あ り、agrOcybyne
Fig. 20. ESIMS (+) spectrum of 2.
５ ０
1
2197● m‐
80
%T
￨
3136om・
1
1
(C=C)
(NH2)
1652● m■
(C=0)
60
50
4000
3000
2000
Wa"numberlCm■
Fig.21.IR spectrum of 2.
‐16・
1000
1
400
Fi/g.22.1H NMR spectrum of 2 (in CDG|3).
Fig, 23. rac NMR spoctrum of 2 (in CDCI3).
F:g.24.DEPT spectrum of2 on CDCi3)・
‐17‐
２ ３ ４
/
―
Fig.25.HMQC spectrurrl of 2(in CDC13)・
5
4
Fig. 26. COSY spectrum of 2 (in CDCI3).
‐18‐
Fig.27. HMBC spectrum of 2 (in CDCI3).
‐19‐
Table 2. 1H and r3C NMR data for 2 (ln CDCIa).
Poslt:。 n
lH
13c
HMBc
δ
lH t。 13c
δ(muliplicity,」 in Hz)
1548
810
85.5
552(d,162)
6.42(ddd,162,73,72)
213(m)
143(m)
090(t,73)
1073
151 2
2,6
3,6,7
354
7,8
215
5,6,8
13.5
6,7
Fig. 28. Agrocybyne B (2),
‐20
2‐ 2‐
3化 合 物 3の 構 造 解 析
3は 白色非品質 として単離 された。HR… ESIMSに お いて
た 156.0415[M+Na]+
“
(CalCd fOr c8H7NNaO,156.0425)の 分子イオン ピー クが観測され、分子式を C8H7NO、 不飽和
化合物
度を
6と 決 定 し た
(Fig。 30)。
IRに お い て
れ ぞ れ 吸 収 ピー ク が 観 測 さ れ た
(Fig。 31)。
1611(C=0)、 2216(C≡ C)、 3160 cm l oH2)に そ
lH―
NMR、
BC‐
NMR、 DEPT、 HMQCに
1つ 、メチ ンが 2つ 、4級 炭 素が 5つ 存在 す る ことが 明 らか にな った
チル が
Table 3)。
各種 ス ペ ク トル デ ー タ の 比較 によ り、化 合物
相 関 (H8/C4,C5,C6,C7)お よび δH 5。 62(lH,dd,J=H.O
(a― octa… 6¨ en‐ 2,4… diynamideと
名 した
一
HMBCの
Hz,H6)の 結 合定 数 によ り、 (a― ペ
29,36,37,Table 3)。 以 上 によ り、 化 合物
決定 した。 化 合 物
(Fig。 38)。
COSY
Fig.29。
(Fig。
(Fig。 32‐ 35,
3は 化 合物 1の 2つ の メチ レンが
オ レフ ィ ンにな った 類縁体 で あ る ことが 示 唆 され た。COSYの 相 関 (H7/H6,H8)、
エ ンイ ンの 部 分構 造 を 決定 した
ン トー
よ り、 メ
HMBC
→
COSY and HMBC correlations:n3.
‐21‐
3は 新規化 合物 で あ り、agrOcybyne
3を
Cと 命
Fig. 30. ESIMS (+) spectrum of 3.
105
1∞
l
3136● m‐ 1
{NH2)
l
2216● m・￨
(Cヨ C)
80
:
161l om・ l
%T
{C=0}
60
50
4000
3000
1000
2000
Wa"nulnborlcm“
Fig. 31, lR spectrum of 3.
‐22‐
l
400
Fig. 32. rH NMR spectrum of 3 (in CDaOD).
Fig. 33. rsG NMR spectrum of 3 (in CD3OD).
Fig. 34. DEPT spectrum of 3 (in GD3OD).
‐23‐
・ １■ ■ 月 １ ４ ● ● ● 寝 Ｉ 々
一‘ Ｉ 仁 こ 嬌 Ｉ Ｉ ３ こ １ ，
４ ∴
．
，
，
Fig.35.HMQC spectrum of3(in CD30D).
7
6
６
７
Fig. 36. COSY spectrum of 3 (in CD3OD).
‐24・
Fig. 37. HMBC spectrum of 3 (in CD3OD).
‐25‐
Table 3. rH and i3C NMR data for 3 (in CD3OD).
Ｃ δ
Posit:on
lH
δ(muLip‖ city,」 in Hz)
HMBC
lH l。
13c
156.3
755a
768a
705a
809a
5.62(d,dd,110,1.5)
637(dq,110,70)
1.93(dd,70,1.5)
a
1088
1473
167
lnterchangeable between the same letter.
Fig. 38. Agrocybyne G (3).
‐26‐
4,5,6,7
2‐ 2‐
4化 合 物 4の 構 造 解 析
化合物
4は 自色非品質 として単離 された。HR… ESIMSに お いて 4/z156.04H[M+Na]+
(CalCd fOr c8H7NNaO,156.0425)の 分子イオン ピー クが観測 され、分子式を C8H7NO、 不飽和
度を
6と 決 定 し た
(Fig。 40)。
IRに お い て
れ ぞ れ 吸 収 ピー ク が 観 測 され た
チルが 1つ 、メチンが
Table 4)。
(Fig。 41)。
1650(C=0)、 2222(C≡ C)、 3158 cm l oH2)に そ
lH―
NMR、
各種スペ ク トルデー タの比較によ り、化合物
H8/C4,C5,C6,C7)お
NMR、 DEPT、 HMQCに
2つ 、4級 炭素が 5つ 存在す ることが明 らかになった
こ と が 示 唆 さ れ た 。 COSYの 相 関 (H7/H6,H8)、
(Fig。
一
→
Fig.39.COSY and HMBC correlations in 4.
‐27‐
(Fig。 42中 45,
(H6/C4,C7,C8;H7/C5,C8;
結 合 定 数 に よ り、 o― ベ ン ト¨
4を
4は 合成 中間体 として知 られて い るが
HMBC
よ り、 メ
ε
おぃ
異性体である
以 上 によ り、化合物
か ら単離 されたのは最初 であ り、agrOcybyne Dと 命名 した
COSY
相関
Hz,H6)の
39,46,47,Table 4)。
diynamideと 決定 した。化合物
4は 化合物 3の
HMBCの
よ び δH 5。 67(lH,dd,ノ =15。 8
エ ンイ ンの部分構造 を決定 した
6¨ en¨ 2,4…
13c…
(Fig。 48)。
52,53、
(o-Octa_
天然物
Fig. 40. ESIMS (+) spectrum of 4.
110
100
80
1
3158 cm■
(NH2)
%T
l
2222 cm■
(CEC)
40
:
1650● m・ I
{C=0)
0
4000
3000
2000
鴨
"numborl●
Fig. 41. lR spectrum of 4.
‐28・
m● I
10∞
400
Fig. 42.1H l{MR spectrum of 4 (in CDaOD).
Fig, 43. r3C NMR spectrum of 4 (in CD3OD).
Fig. 44. DEPT spectrum of 4 (in CD3OD).
‐29‐
:::
':〕
`￨'
5_∞
4∞
3.∞
ｒ∞
6∞
﹂
ｒ
一
．
〇
ｔ ｌ ・■ ⋮ ‘ ｏｌ ｌ ■ １ ４ ご ヽ ７ １
↓
００・
０
︺０ ０
，
●′ ●む ‘ Ｆ ｌ
///2,4
-一 -3
― -5
●
﹂一
Ｆ
ム﹂。
︰・
・
6
Fig.45.HMQC spectrum of4(in CD30D).
7
6
Fig. 46. COSY spectrum of 4 (in CD3OD).
‐30‐
４
２ ３ ５ ６
Fig. 47. HMBC spectrum of 4 (in CD3OD).
Table 4. rH and r3c NMR data for 4 (tn cDsoD).
Ｃ δ
Position
lH
δ(multplicity,」 in Hz)
HMBC
lH t。
13c
156.4
70.9a
742a
708a
83.1
a
567(dd,158,18)
1096
4,7,8
6.50(dq,15.8,7.0)
148.4
5,6,8
185(dd,7.0,18)
191
lnterchangeable between the same letter.
Fig. 4E. {grocybyne D (4).
‐32‐
4,5,6,7
2‐
2"5化 合 物 5の 構 造 解 析
5は 自色非品質 として単離 された。HR… ESIMSに お いて
化合物
4/z216。 0608[M+Na]+
(CalCd fOr c10HllNNa03,216.0637)の 分子イオ ンピー クが観測 され、分子式を CЮ HllN03ヽ 不
6と 決 定 し た
飽和度 を
(Fig。 50)。
そ れ ぞ れ 吸 収 ピー ク が 観 測 さ れ た
メチルが 1つ 、メチ レンが
52-55,Table 5)。
基 をもつ
4。
Table 5)。
51)。
lH―
NMR、 13c_NMR、 DEPT、 HMQCに
(Fig。
相関
13;δ c 62.7,170。
さ ら に 、HMBCの
8…
相 関 (H1/Cl';H2'/Cl')お よ び 化 学 シ フ トの
9)に よ り、 アセ トキ シメチル の部 分構 造 を 決定 した
amino-8-oxooCta‐
agrocybyne Eと 命 名 した
4,6‐ diynyl
COSY
一
(Fig。
HMBC
→
Fig.49.COSY and HMBC correlations in 5.
・ 33‐
(Fig。
(δ
49,57,
c 64.3,67.5,
49,57,Table 5)。 以 上 によ り、化
acetateと 決定 した。化 合物
(Fig。 58)。
(H2/Hl,
よ り、プ ロ ピ ル の 部 分 構 造
さ らに、HMBCの 相 関 (H2/C4;H3/C4to C7)お よび 化 学 シフ トの 値
5を
(Fig。
5は 化合物 1に カルボキシ
(H1/C2,C3;H2/Cl,C3;H3/Cl,C2)に
49,56,57)。
よ り、
3つ 、4級 炭素が 6つ 存在す ることが 明 らかになった
71.2,85。 4)に よ り、ブ タ ジイ ンの 部分構造 を決定 した
合物
l oH2)に
2つ の炭素が結合 した類縁体 であることが示唆 された。COSYの 相関
を 決 定 した
(δ H
(Fig。
1613(C=0)、 2243(C≡ C)、 3178 cm‐
各種スペ ク トルデー タの比較によ り、化合物
H2)お よ び HMBCの
値
IRに お い て
5は 新 規化 合物 で あ り、
Fig.50.ESIMS(+)SpeCtrum of 5.
105
100
80
%T
:
3170 om・ l
(NH2)
60
:
2243 om●
1613● m・ I
{C=C)
(C=0}
50
4000
3000
2000
■餞ぃ nunborlCm■ 1
Fig.51.IR spectrum of 5.
・ 34‐
10∞
400
Fig.52.lH NMR spectrum of5(in CDCi3)・
Fig. 53. r3C NMR spectrum of 5 (in CDCI3).
F:g.54.DEPT spectrum of5(in CDC13)・
‐35・
Fig.55.HMQC spectrulm of 5(in CDCi3)・
1
２
２ ３
Fig. 56. COSY spectrum of 5 (in CDCI3).
‐36‐
Fig. 57. HMBC spectrum of 5 (in CDCI3).
‐37‐
Table 5. lH and r3C NMR data for o (in CDcl3).
Ｃ δ
Position
1H
6 (multiplicity, J in Hz)
HMBC
lH t。
13c
627
2,3,1'
2
413(dd,64,61)
188(m)
27.0
1,3,4
3
243(dd,7.3,67)
164
1
4
854a
5
64.3a
6
712a
675
1534
1709
7
8
1'
2'
1,2,4サ 5,6,7
204(s)
20.8
" lnterchangeable between the same letten
Fig. 58. Agrocybyne E (5).
‐38・
1'
2‐ 2‐
6化 合 物 6の 構 造 解 析
化合物
6は 無色油状物質 として単離 された。HR― ESIMSに お いて
4/z233.0410[NII―「Na]+
(CalCd fOr c10H10Na05,233.0426)の 分子イオ ンピー クが観測 され、分子式を C10H1005と 決定
した
た
(Fig。 60)。
(Fig。 61)。
IRに お い て
lH―
NMR、
13c…
1627(C=0)、 3287 cm・
NMR、 DEPT、 HMQCに
(OH)に そ れ ぞ れ 吸 収 ピ ー ク が 観 測 さ れ
よ り、メ チ ル が
1つ 、メ チ レ ン が 1つ 、
メチ ンが
3つ 、 4級 炭 素 が 5つ 存 在 す る ことが 明 らか に な った
HMBCの
相関
の値
(δ H
10。
(Fig。
62¨ 65,Table
6)。
(C2-CHO/C2,C3,C4;3-OH/C2,C3,C4;H4/C2,C3;H6/C2)お よび 化学 シ フ ト
1,12.3)と δH 6。 35(lH,d,J=2.O Hz,H4)、 δH 6。 45(lH,d,J=2.O Hz,H6)の 結 合定
数 によ り、2つ の 水 素原 子 が メタ位 に存 在す る2… ヒ ドロキ シ ベ ンズ アル デ ヒ ドの 部分構 造 を
決定 した (Fig.59,66,Table 6)。
さ らに、HMBCの 相 関
H2'/Cl')お よび 化 学 シ フ トの 値
(δ H
5。 29;δ c
62.5,170。
(Cl… CH2/Cl,C2,C6,Cl';H6/Cl― CH2;
3)に よ り、 アセ トキ シメチル の 部分
構 造 を決定 した (Fig.59,66,Table 6)。 また、 HMBCス ペ ク トル の 相 関 (H4/C5,CQ H6/C4)
お よび 化 学 シ フ トの値
Table 6)。
物
(δ
c 162.8)に よ り、 ヒ ドロキ シ基 の 部分構造 を決定 した
以 上 によ り、 化 合 物
6を
6の アル コー ル 部 分 で あ る
2¨ forlnyl‐
2,4-dihydroxy…
(Fig。
59,66,
3,5-dihydroxybenzyl acetateと 決定 した 。 化 合
6¨
(hydrOttmethyl)benzaldehydeは 天 然 物 と し
rgJJJ7s rag"あ s霞 の 変 異体 か ら単 離 され た の が 最 初 で あ るが 54、 化 合物
て Иψθ
物 で あった
(Fig。
67,68)。
Fig.59。 HMBC corre:ation in 6.
‐39‐
6は 新 規 化合
Fig. 60. ESIMS (+) spectrum of 6.
５ ０
￨
3287 cm l
(OH)
l
1627● m‐
1
{C=0)
%T
60
50
4000
2000
3000
Wavenum6erlcm●
Fig. 61. lR spectrum of 6.
‐40‐
1000
I
400
Fig. 62. rH NMR spectrum of 6 (in CDCta).
Fig. 63. 13C NMR spectrum of 6 (in CDCI3).
1‐
Fig.64.DEPT spectrum of 6(in CDCi3)・
・ 41‐
CH2
４
６
′ ′
′ ′
′
︲ ︲ ︲
１ １
1‐
CH2
￨
1-CH2
_4
、
6
-1
_5
-3
-1,
2.CHO
Fig.65.HMQC spectrurrl of 6(in CDCi3)・
3‐
OH
2‐ CHO
玉
ヽ
Fig. 66. HMBC spectrum of 6 (in CDCI3).
‐42‐
:
1,
Table 6. rH and 13C NMR data for 6 (in CDCI3).
Ｃ δ
Position
lH
6 (multiplicity, J in Hz)
1
1 CH2
529(s)
2
2-CHO
101(S)
3
3‐
4
OH
123(s)
635(d,20)
5
6
645(d,20)
l'
2'
1413
625
1128
1925
1664
211(s)
HMBC
lH t。
13c
1,2,6,1'
2,3,4
2,3,4
1037
1628
1105
1703
209
2,3,5,6
2,4,1-CH2
1'
Fig. 67. 2-formyl-3,5-dihydroxybenzyl acetate (6).
Fig. 68. 2,+dihydroxy-6-(hydroxymethyl)benzaldehyde.
The compound have been isolated from mutant strains ol A. rugulosus.
‐43‐
2‐ 2‐
7化 合 物 7の 構造解 析
化合物
7は 無色油状物 質 として単離 された。ESIMSに お いて 4/z175[MttNa]+の
イオ ンピー クが観測 された
吸収 ピー クが観測 された
(Fig。 70)。
(Fig,71)。
分子
IRに お いて 1627(C=0)、 3245 cm・ (OH)に それぞれ
lH―
NMR、 13c_NMRお よび 各種 ス ペ ク トルデー タの比
較 によ り、化合物
7は 化合物 6の アセ トキ シメチルが メチル にな った 類縁体 である こと
が示唆 された
72,73,Table 7)。
(Fig。
構造解析 によ り、化合物
hズЮxy-6‐ methylbenzaldehyde)と 同定 した
55、
れてお り
(Fig。
69,74)。
7を
化合物
ο¨
orsellinaldchyde(2,4‐
di
7は 合成 中間体 として知 ら
天然物 として И.″ ν あs堺 の変異体 か ら単 離 されたのが 最初である54。 また、
生物活性 として 、 ヒ ト肝腫瘍細胞 (Hep 3B cell)に 対 して特異的 にアポ トー シス を誘 引す る
細胞毒性が報告 されて い る
56。
HMBC
→
Fig.69.HMBC corre:ation in 7.
‐44‐
Flg. 70. ESIMS (+) spectrum of 7.
105
100
:
3245 om・
1
(OH)
l
1627● m■
(Cヨ 0)
80
%T
00
50
4000
3000
2000
W●‐ ―
F:g.71.IR spectrum of 7.
‐45‐
bor“ x■ ■1
1000
400
Fig.72,1H NMR spectrum of 7 (in CDGI3).
Fig. 73. r3C NItllR spectrum of 7 (in GDCI3).
‐46‐
Ｃ δ
Table 7. rH and r3C NMR data for 7 (in CDCI3).
lH
δ(muLip!icity,」 in Hz)
13c
1136
1
1‐
CHO
101← )
OH
124(s)
2
2‐
619(s)
3
4
619(s)
5
6
6‐
HMBC
lH t。
CH3
251(s)
1929
1663
1,2,3
1,2,3
1013
1632
1105
1449
182
Fig. 74. o-Orsellinaldehyde (7).
47‐
1,2,4,5
1,3,4,6‐ CH3
1,5,6
3節
第
植物成長調節活性試験
フミヅキタケの培養ろ液 の酢酸 エチル可溶部か ら単離 した各化合物 について、レタス (キ
ク科
イネ
)、
2‐ 3‐
(イ
ネ科)お よびイチ ゴ (バ ラ科)に 対す る植物成長調節活性試験を行 った。
1レ タ ス に 対 す る 植 物 成 長 調 節 活 性 試 験
レタスの種子を播種 して 1日 間前培養 を行 い、発芽 させた後 、l nm01∼
l
μmolに 濃度調
整 した agrocybynes A… E(1‐ 5)お よび化合物 6,7を それぞれ処理 して 3日 間本培養を行っ
た。その結果、agrOcybynes A(1),E(5),化 合物 6,7は 10 11mol以 上、agrOcybynes C(3),D(4)
は l nmol以 上で胚軸 または根 の伸長阻害活性 を示 し、agrocybyne B(2)は
1011m01以 上で
胚軸 の伸長阻害活性および根 の伸長促進活性 を示 した。また、agrocybynes A(1),B(2)は
nmolで 胚軸 の伸長促進活性 の傾向 も観察 された
■ hypocotyl,警
1
(Fig。 75)。
rool
160
1“
”
。
０
。
８
。
６
“
０
一０﹄
Ｅ００い
ｏ︵
●﹄〓ｔ５０﹄
”
ド︶●︺
ヾヾヾ へヾヾヾ へヾヾヾ へヾヾヾ へヾヾヾ へヾヾヾ へヾぽヾ
Fig. 75. Effect of compounds 1-7 on the growth of Iettuce.
Lettuce seedlings were treated with compounds 1-7 (1 nmol - 1 pmol). The lengths of the
hypocotyl and the root were measured using a ruler. Results are the rate of growth length
comparedwithcontrol +standarddeviation(*P<0.05,**P<0.01 vscontrol,n=7).
‐48・
以 上の ことか ら、 フミヅキタケの培養 ろ液 の酢酸 エ チル可 溶部 か ら単離 され た 各化合物
は植物成長 調節活性物質 として機能す る ことが 示 された。
2‐ 3‐
2イ ネ に対 す る 植 物 成 長 調 節 活 性 試 験
イネの種子 を播種 して 3日 間前培養 を行 い、発芽 させた後、 lnM∼
lμ
Mに 濃度調整 し
た agrocybynes AttE(1¨ 5)を それぞれ処理 して 1週 間本培養 を行 った。そ の結果、agrOcybyne
A(1)は l nM以 上、agrOcybyne C(3)は 100 nMで 根 の伸長阻害活性を示 した。また、
agrocybyne A(1)は
lμ
Mで 地上部 の伸長促進活性、agrOcybyne
上部 または根 の伸長促進活性 の傾向 も観察 された
■
160
B(2)は
100 nM以 上で地
(Fig。 76)。
shoot,日 『00t
140
。
２
。
０
。
８
。
６
“
０
舎ｏ﹄
〓ｏＯい
ｏ︵
Ｇ﹄〓ｔ５ｏ﹂
︺
ざ︶０︺
ぽ ヾヾ
Fig口
ヾヾヾ
ご ヾご
ヾぽヾ
ヾヾヾ
76.Effect of compounds l‐ 5 on the growth ofrice.
Rice seedlings were treated wlh compounds l‐ 5(l nM‐ l μM).The lengths ofthe shoot
and the root were measured using a ruler.Results are the rate of gЮ wth length compared
wlh contЮ I± standard devialon c Pく o.05,最 Pく 0.01 vs contЮ I,n〓
2-3‐
16).
3イ チ ゴ に対す る植 物成長調節活 性 試験
イチゴの幼苗を園芸用土 に移植 して 1日 間前培養 を行 い、l
‐49‐
nmo1/soil・
mLに 濃度調整し
た agrocybynes A― E(1-5)を それぞれ 処 理 して
ynes A‐ E(1…
され た
5
一
1
週 間本培養 を行 った。 その結果 、agrOcyb―
5)全 て に植物体 の枯死が観察 された。また、agrocybyne
B(2) は根 の伸長 も観察
(Fig。 77)。
￨
:
￨
Fig.77.Effect of compounds l‐ 5 on the growth Of strawberry.
Strawberry seediings were treated with compounds l‐ 5(l nmoySOi卜
mL,n=3).
Agrocybynes A― E(1¨ 5)は 顕著 な活 性 を示 した ことか ら、フ ミヅキ タケが ィチ ゴの 実 の 成長
に対 して 影 響 を 与 えた主 な活 性 物 質 で あ る可 能 性 が 示 唆 され る。 現 在 、 agrOcybyne類 の イ
チ ゴの 実 に対 す る植物 成長 調 節活 性 試験 を試 みて い る。
‐50‐
4節
第
フ ミヅ キ タケ 由来 の 植 物 成 長 調 節 物 質 の 合 成
フミヅキタケの培養 ろ液の酢酸 エチル可溶部か ら単離 した agrOcybepcsは 収量が少な
いことか ら、植物成長調節活性試験 についてよ り詳細な実験を可能にするために、各化合
物 の安定的供給を目的として有機合成を行った。
2… 4‐
l AgЮ cybyne Aの 合 成
2-Hexyn-1-ol(1■ )18gを 原料 として、Swem酸 化 によ り hex_2‐ ynal(2b)を 得た後、
Corcy
Fuchs反 応 により
1,1-dlbromohept‐ 1‐ cn‐ 3-yne(lC)を 経て
octa‐ 2,4-dynoic
mg(収 率 32%)得 た。 さらに、 メテルエステル化 によ り methyl
718 4 mg(収 率
82%)得 た後、アミ ド化 によ り agrOcybync
A(1)を
acid(ld)を
790.2
(10を
mg(収 率 54%)合
octa_2,4‐ diynoat。
38.6
成 した (Rg.78)。
讚 ￨「N
イ
￨マ Yl滞器
E:● Ю℃
Alrocybyne A(イ
)
Fig.78.Synthesls of agrocybyne A.
2¨ 4‐
2 Agrocybyne Bの 合 成
o‐ Hcx-2-enal(2o)2.Ogを 原料 として、cOrey‐ Fuchs反 応 によ り o-1,1-dlbrOmohepta l,3‐
dicne(2b)を 経て o‐ oct‐ 4‐ cn-2-ynoic acid(2c)を 20g(収 率 73%)得 た。さらに、メチルエ
ステル化 によ り
(o‐ methyl oct4-en‐
2‐ ynoate(2●
)を 176g(収 率 80%)得 た後、アミ ド化 に
よ り agrOcybyne B o)を 617 2 mg(収 率 39%)合 成 した
(Fig。 79)。
CHρ ,¨
H
M● IK,Cq
NH,(11〕
ap 6“
Atrccyiyno
Fig. 79. Synthesis of agrocybyne B.
‐51
B
(2)
2¨
4■ Agrocybynes C¨
Eの 合 成 計 画
Propaglalcoholを 原料 として、漁ヵゅ
"ッ "ene,"ぉ
‐
broll10propelle,oxctaneを それぞれ
反応 させた後、上記 と同様 の方法で Swcrll酸 化、Corey Fuchs反 応、メチルエステル化、
アミ ド化 を行 い、agrocybynes C‐ E● ‐
5)の 合成を試みて いる ct 80)。
¨
輌
/2.-4/.?'
pro!.ryu|alcohol
e6rhr
- 3郡
38
躍 1・ 御
お蹄脇肝
/■4a
l}需 幣P
v∨ /｀
3漱 剛
6a
Fig. 80. Synthetic strategy of agrocybynes C-E.
‐52‐
興
お臨簡P●
5,‐
￨●
I●
‰
5節
第
考察
フミヅキタケ の培養 ろ液か ら単離 された agrOcybynes A― E(1‐ 5)の 構造 ―活性相関につい
て考察 した。レタス に対す る活性 にお いて 、ジイ ンの部分構造 をもつ agrOcybynes A(1),C(3),
D(4)は イ ンエ ンの部分構造 をもつ agrOcybyne B(2)よ
りも顕著な活性が確認 され た一方
で agrocybyne E(5)に は隠微 な活性が確認 された ことか ら、ジイ ンまたはイ ンエ ンの部分構
造 が活性強度 と調節作用 に関与 し、 末端 の部分構造 の空間的な大 きさが活性 に対す る選択
性 に関与 して い る ことが示唆 され る
(Fig。 81)。
significant
position
(selectivity)
significant
position
(activity)
Fig.81.Structure‐ activity relationship of agrocybynes toward lettuce.
イチ ゴ に対 しては、agrOcybynes A― E(1‐ 5)全 てに顕著 な活性が確認 され、さ らに、長期 間
培養後 には対照 区 も含 めた全ての処理 区 にイチ ゴの植物体 の枯死 が 確認 された ことか ら、
イチ ゴの体 内 または体外 で agrOcybyne類 が 揮発性 の物質 に代謝 され た ことで イチ ゴの植
物体 の成長 に影響 を与 えた可能性が示 唆 され る。
Agrocybynes A… E(1‐ 5)は polyacetylene類 に分類 され る化合物群 である。Polyacetylene類
は 天 然 物 と して 、 担 子 菌
『
stron…
″
θ′
ω滋
′
θ
ル″ο′
た力α)に 由来 す る
“
ハマウ ド に電グ′
Cα ノ
″
Jε α
ψο
)に 由来する
xertllinic acid57、
メン
(4%腸
(&″ 偲 ブ υ 力ο″ )OkinaWa,■
gylodiols60,“
“
xerlllin57,dihydroxertllin57,
falcarindio158,japOangelols58、
ヵィ
ssJ“ α)に 由 来 す る durissimols59,
4ν ′
の 力ο″ あ ″′
等 、約 2000種 類 の化合物が単離 されている
(Fig。
82)62。
また、生物活
性 として、xertllin、 dihガ Юxertllinは ヒ ト子宮頚腫瘍細胞 (Hela S3 cell)に 対する細胞毒性57、
falcarindiolお
よび japoangelols A― Dは ヒ ト胃腫瘍細胞 (MK-l cell)お よびマ ウス皮膚腫瘍
58,63、
細胞 (B16F10 cell)に 対す る細胞毒性
59、
対する細胞毒性
sttongy16diols A―
du五 Ssimol
Bは ヒ ト胃腫瘍細胞 α UGC cell)に
Cは ヒ ト白血病細胞 (MOLT-4)に 対す る細胞毒性60等
が報告 されている。さらに、 トマ ト 6ο ル″″ ″Cの θ
だJε )や ニ ンジン の α tt ε
αЮ″)が
"ε
"″
“
産生す る falcarindiolは 葉カ ビ病菌 (CJaぁψο
″
′ ルル″ )や 灰色カ ビ病菌 ￠.cJ″ θ
″
θ
α)に
"“
“
64,65、
対す る抗菌活性
ソラマ メ (レ7ε 滋力bα )が 産生す る sa均 ■olは 赤色斑点病菌 o.ヵ bα θ
)
‐53‐
に対する抗菌活性66、 ベニバ ナ (Orrm物
"励 "")が 産生する wyerOneは ツルムラサキ
激
″ 酵echsル 77D、 褐色斑点病菌
疫病菌 c″ 物■滋ο
′
″″
″
αtt ι
αttα め に対する抗菌活性 69
“
が確認 されてお り、 これ らの化合物は菌類 と植物
“との相互作用に関与する phytoalexinsと
して報告 されている
c滋 ′
″α)、
67‐
_方 、イチゴが産生する
(Fig.82)62。
hcX-2-enalも
oつ ‐
灰色カ ピ病菌
c
炭疸病菌 (C αc劾 物 ″)に 対する抗菌活性が確認 されてお り、さらに、病原菌に対
する抵抗性を向上させる揮発性 の物質として機能 していることが報告されている23‐ 25,29。
-')
-zl/:\'/a\'//\\/'\z
Xeru‖ n
'.. -\
'\,/
""{
‘
‘・
- -"/-
"*'o*'";;"//'\..-
Dihydroxerulin
ヽ ，
ヾ
｀
ヽ
/パ
、
ぐ
Xerulinic acid
t
Falcarindiol
rn, -
Japoangelol A c, '
/ヽ /″
″/″
´
グ
´
r.r.
a,.
xr
x, a, = x.
n.. ocxJ, B (R,'x, R,=H n,=ocr.), C (a,.x, n.=x.
´
͡_/tゞ ン｀
へ｀ ｀´
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a.=H1,
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16, = y,
V´
ヽレ´卜、
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｀_l´ 情つヽ ヽ
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今、
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ヽ、″ 、 '′
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1、
■F.1ヽ
'卜
ノイ
′ヽ
■
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°イ
J
￨
F:g.82.Chemical structures of polyacetyienes.
Each compound has been isolated from natural sOurce;xeru‖
n,dihydroxen」 ‖
n and xeru‖ nic
acid from the mushroom(fungus)falCa‖ ndiol,iapoangeiols,sa"nOl and wyerone from the
vegetables(plantS)dunSSim。 ls and strongylodiOls from the sponges(animals)
フミヅ キ タケが 産 生す る agrocybyne類 やイ チ ゴ が 産 生す る oつ ‐
hcX-2-enalは 酢酸 ―マ
‐54・
ロ ン酸経路 によって生 合成 され る ことが予想 され62,70、 agrocybyne類 や o‐ heX-2‐ enalが こ
の 生 合成経路 を仲介す る ことで互 いの相 互 作用 に重 要な活性物質 として機能 ある い は代謝
されてい る ことが示 唆 され る
/1、 sc“
Acety卜 CoA
‖
ヽ
/′ ｀
′
H。 /J、 、
scぃ
+ Malonyl_CoA
lli菫
ヘ
ヽ イ 、͡
二
(Fig.83)。
_
//｀ ｀
、/´ ｀、ノヘ 、。
(ご)‐ Hex… 2‐ enal
EllatepathWay
_/1‐ 、H
2
2 Acetylenase
Iム
o
II
-r(
z2?
4 Desaturase
￨△
Agrocybyne B
-
(E)-Hex-2-enal
′｀
′
。
′
′
′
多
〃
ヽ
′ヽ
ヽ
′
υ′
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H
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//'イ
i//′
一＼
4 Acetylenase
￨△
r/ブ
、
｀
ヽク
Agrocybyne A
｀
―fyば
了
/′
リ
/
ノ
に
NH,
タ
AgrocybyneC
人岬
,
Agrocybyne D
Fig.83.Hypothesis rnetabo‖ c pathway of agrocybynes A‐ E and cherrlicaiinteractions
beh″ een the fungus ol.praecOxl and the p:ant(strawberry).
菌類 と植物 との相互作用 をよ り化学的に解明す ることで、生化学的、生物有機化学的な
基礎研究面と、農業的な応用面 に対する貢献 を期待できる。
‐55‐
第
第
1節
3‐ 1¨
3章
実験部
使用機器および材料
1機 器類
NMR
Jヽ N― EX‐
270F「 珊 R Spectrometer KJEOD
Lambda 500 F「 NIIIR Sp∝ trometer(JEOD
MS
IR
IPLC
Accu TOF LC‐ plus JMS‐ T100LP Mass Specmmctcr(JEOD
A‐ 102
Di■ adoll e灘電 Inhred Spectrometer(JASCO)
SenshI PAKAQ(ScnShu scbα iic Co.,Ld)
Column
COSMOSIL TNAP Waters oacalaltesque)
COSMOSIL 5Rtt Watcs cnaCdd tesqucp
PU2089 Plus Quatmary GradientPmp KJASCO)
Pump
PU‐ 2080
Pluslntelluttt HPLC Pmp KJASCO)
L2130 oII「 ACHD
ヽ こ 075 Plus htel■ gent UV/VIS Detector(JASCO)
Detector
875‐ UV
htclttt UV/VIS Dctcctor KJASCO)
とodc Amy Detectorし 2455crrACHD
Recorder
807-IIr htertOr(JASCO)
Automatic sarrpler
AS‐ 2055 Plus h"1ligcnt Samplcr cJASCO)
Software
Chromatography Data S協 ion ChromNAV KJASCO)
ELI「 EcIIFACHD
LCNeI1/ADC cASCO)
Interface
Sha gel
60N for column chrornatography (Kanto Chemical Co., Inc.)
TLC
DC-Alufolien Kieselgel 60 F2s4 (Merck Ltd.)
DC-Alufolien
RP-
1
8 F25a (Merck Ltd.)
・ 56‐
3¨ 1… 2
材
料
新潟県 のビニー ルハ ウスよ り単離 。同定 されたフミヅキタケの種菌 (亀 ″りb´ p″ ′
ο
α
F450)を 使用 した。フミヅキタケの単離 。同定は新潟県森林研究所 の松本則行 によって行わ
れた。植物成長調節活性試験 には、レタスの種子
ネ の種子
ヮ″
を使用 した
“。
sα
″″,日 本晴
)、
励 L cv Great Lakes 366)、 イ
“
″α αDuchesnc,紅 ほっぺ)
イチ ゴの幼苗 cれ妥滋 Xα ″α
“
‐57‐
lZaο ttCα
2節
第
フミヅキ タケ苗来 の植 物 成長 調 節物 質 の 単 離 。精 製
フミヅキタケの種菌 をポテ トデキス トロース液体培地 (20L;0.4%ポ テ ト抽出物、20%
デキス トロース、Difco;0.1%ア ク トコール、Takeda Chemical hdusdes Ltd.)を 注入したジ
ャー ファメンター (30L;Bio■ Co,Ltd.)に 移植 し、温度
グ l Vmmの 条件で
回転数 100Ψ 転 バプ リン
25° C、
3週 間培養 を行った。その後、遠心分離、ろ過 によって菌糸体 と培養
―
ヘキサン (1回
ろ液に分離 した。菌糸体は凍結乾燥後破砕 し、″
ノール (3回
)、
酢酸エテル (3回 エタ
‐
ヘキサン可溶部
水 (3回 )で 順次浸漬抽出を行 い、菌糸体 (495 glか ら ″
酢酸エテル可溶部
(178g)、
(17 3 gl、
)、
819を 得た。
エタノール可溶部 (157D、 水可溶部
培養ろ液は減圧濃縮後、酢酸エチル 14回
養ろ液
)、
(175Dか ら酢酸エチル可溶部
)、
‐
″
プタノール 14回 )で 順次分配抽出を行
“
い、培
(198 gl、
―
″
プタノール可溶部
(74.2g)、
水可溶部
(1.75 kg)を 得た。
(198g)を シ リ カ グ ル の フ ラ ッ シ ュ カ ラ ム ク ロ マ
培 養 ろ液 の 酢 酸 エ チ ル 可 溶 部
トグ ラ フ
イ ー (SiliCa gc1 60N,250g,35 φ X 520 mln;CH2C12,CH2Cち /EЮ Ac90:10,80:20,7030,60:40,
5α 50,EtOAc,EtOAc/MeOH
5050,MeOH)に よ り 12画 分 に 分 画 し た 。 画 分 3(54 1 mg)は
HPLC(SenShu PAK AQ,20φ
,債 相
さ らに、画 分
3-6(8.O mglか
MeOH/H204060)に
×250 nlm;4-hexane/CHC13 2080)に よ り
ら逆 相
よ って 化 合物
7画 分 に 分 画 し 、
HPLC cOSMOSIL TNAP Waters,20
7(23mDを
単 離 し た 。画 分
4(3486 mDは 順 相 HPLC
(SenShu PAKAQ,20φ ×250 mm;″ ‐hcxanc/CHC13 2080)に よ り 9画 分 に 分 画
分
4‐
5(20.6 mglか
ら逆 相
4α 60)に よ っ て 化 合 物
HPLC(COSMOSIL NAP Wate,20φ
φ X 250 nlln;
× 250
し 、 さ ら に 、画
mm;McOH/H20
1(5.6m9,2(6.7 mgl,3(1l mg),4(22 mgl,6(0.6 mg)を そ れ ぞ れ 単
離 した 。 画 分
5(606 1 mglは 順 相 HPLC(ScnShu PAK AQ,20ψ ×250 xnm;″ ―
hexane/CHC13
2080)に
8画 分 に 分 画 し、 さ らに 、 画 分
より
5‐
5(52.9 mg),5-6(290 mg)は
(COSMOSIL ttAP Wats,20ψ ×250 mm:MeOH/H204060)に
した 。さ らに、画 分 5-5-6(1.3 mg),5-6-6(3 9 mgpか ら逆 相
よ りそ れ ぞ れ
HPLC
7画 分 に 分 画
IIPLC(COSMOSIL 5RT Watcrs,
20φ
×250 nlm;McOH/H2040:60)に よって化合物 2(06 mg,■ om■ acion
■om
tacim 5‐
6‐
逆相
5-5‐
6),5(35 mg,
6)を それぞれ単離した。
Agrocybyne A(1)。 CO10rless necdlci mp 101‐
103° C;IR
lneat,V_l: 1652,2244,3136 om‐
1;UV
19."o:200,218,233,247,261,276 nm;lH and BC NMR,see Fig H, 12 atld Tablc l;ESIMS“ /z
158[MINa]十 ;IIRESIMS″ /z1580559[MINal+(calCd for C8H9NNaO,
Agrocybyne B o)。 Co10rless needle;mp l14‐
116°
C;R● eat,vmo:
‐58‐
1580582).
1652,2197,3136 cm‐
1;UV
13C
Nlr,G, se6 tig.22,23 aad Table 2; ESIMS mlz
'H and
mlz 160.0731[M+Na]- (calcd for CaHrrNNaO, 160.0738).
(1.,o,.): 250 nrn;
Agrocybyne C (3). Wlite amorphous; mp 82-84'C; IR (neat,
(1",*): 220,271,287,306 nm;
1H
aad
13C
NMR,
see
v,-):
16O
[M+Na]*; HRESIIT,IS
1611,2216,3160 crn'l; UV
Fig. 32, 33 and Table 3; ESIMS z/z 156
[M+Na]*; HRESIMS mlz 156.0415 [M+Na]+ (calcd for CsHzNNaO, 156.0425).
Agrocybyne D (4). White amorphous; mp 86-88oC; IR (neat, vnsJ: 1650,2222,3158 cm-r; UV
(I,.J:
21S, 271,287,306 nm;
lH and r3C NM4
see
Fig. 42,43 and Table 4; ESMS mlz 156
[M+Na]+; HRESIMS m/z 156.0411M+Nal+ (calcd for C3H7NNaO, 156.0425).
Agrocybyne E (5). White amorphous;
np 72-74"C; IR
(1",*J: 200, 215,232,246,260,276 nm; 'H and
13C
(neat,
NMR,
v,-):
1613, 2243,3178 crr1; UV
see Fig. 52, 53 and Table
5; ESMS mlz
216 [M+Na]+; HRESMS m/z 216.0608 [M+Na]+ (calcd for C1gII11NNaO3, 216.0637).
Compound 6, Colorless oil; IR (neat, vnrajJ: 1627,3287 cm1; tH ard t3C NMR,
Table 6; ESMS m/z 233 [M+Na]*; HRESIMS m/z 233.0410
see Fig. 62, 63 and
[M+Naf (calctl for
C1sH16].taO5,
233.0426).
a-Orsellinaldehyde (7). Colorless oil; IR (neat,
v,-,):
72,73 andTable 7; ESIMS z/z 175 [M+Na]+.
‐59‐
1626, 3245 cm't; 'H and 1,C NMR, see Fig.
第
3節 X線 結晶構造解析
‐
化合物 1は 無色針状結晶として″
ヘキサン溶液から単離された。回折データは saim70
CCD detcctOrを 備 え 付 け た RIGAKU AFC‐ 8d■ actometcrを 使 用 し た 。ブ ラ ッ グ ス ポ トの
ッ
集積は HKL2000 pro『 耐・ を使用 した。構造は SIR2004 program″ を使用 した直接法によ
り解析を行 い、SIIELXし 97 prorm73を 使用 したフルマ トリックス最小二乗法 によ り精密化
を行 った。
Crystal data.C8H70N,Й =133.15,dolhic P‐
α=115.980(10),β =95.452(8),/=92.299“
κα)=0076
)°
=10594o)Å
,/=7791(3)Aち Dx=1135 Mg r3;z=4;ズ Mo
1,α
mm l,r=9o K
‐60‐
=88879(17),ι =9.2843(19),ο
,
4節
第
3… 4…
植 物 成長調 節活 性 試験
1レ タス に対す る植物 成 長調節活 性 試験
ガラス製のシャー レ (60ψ ×20-lを 使用 し、l mLの 蒸留水を浸透させたろ紙 (Advan
―
tcc No.2,55の にレタスの種子を播種 した。25° C、 暗所の条件で 1日 間前培養を行った。
対照区は CH2C12ま たは
MooHを ろ紙に浸透させ、試験区は CH2Cし
または
MOoHで 濃
度調整 した各種サンプルをろ紙 に浸透 させた。 自然乾燥をさせた後、l mLの 蒸留水をろ紙
に浸透 させ、発芽 したレタスを移植 した。25° C、 暗所の条件で 3日 間本培養を行った。培
養後、レタスの形態の変化を観察するとともに、レタスの胚軸 と根 の伸長 を測定した。
3‐ 4…
2イ ネ に対 す る 植物 成長 調節活 性 試験
イネの種子を脱穀し、70%エ タノールで
3分 間、2.5%次 亜塩素酸ナ トリウムで 15分
間を 2回 繰 り返 して滅菌し、滅菌水で洗浄した。その後、プラスチ ック製の滅菌シャー レ
(85
φX
10 111m)を
使用 し、20 mLの 滅菌水を注入 して、イネの種子を播種した。28° C、 暗所
の条件で 3日 間前培養 を行った。アグリポット (80ψ ×H5-lを 使用 し、04gの 粉末寒
天 、 50
mLの イ ネ 専 用 液 体 培 地 10.40%NHが 03,047%NaH2P04・ 2H20,026%K2S04,0・ 22%
CaC12・ 2H20,0・ 610/O MgC12・
pp■ l CuS04・
6H20,0095%Fc― EDTA,0150/O H2B03,0.010%MnS04・ 5H20,3.75
5H20,10 0 ppm ZnS04・ 7H20,12 ppm NaMo04・
50 μLの エ タノールを培地 に加え、試験区は
2H20)を 加えて滅菌後、対照区は
5011Lの エタノールで濃度調整 した各種サ ン
プルを培地 に加えた。寒天培地を作成 した後、発芽 したイネを移植 した。28℃ 、暗所、6時
間 /28° C、 明所、 18時 間の条件で 1週 間本培養を行った。培養後、イネの形態 の変化を
観察するとともに、イネの地上部 と根 の伸長 を測定 した。
3‐ 4‐
3イ チ ゴ に対 す る植 物成 長調 節活 性 試験
プラスチ ック製のカ ップ o50 mL)を 使用し、滅菌をした園芸用土 (250mり にイチゴの
幼苗を移植 した。18℃ 、暗所、12時 間 /25℃ 、明所、12時 間の条件で 1日 間前培養を行
つた。対照区は 250 μLの
DMSOを 園芸用土に浸透 させ、試験区は 250 μLの DMSOで
濃度調整した各種サンプルを園芸用土に浸透させた。 18° C、 暗所、12時 間 /25℃ 、明所、
12時 間の条件で 1週 間本培養 を行った。培養後、イチゴの形態の変化を観察した。
‐61・
第
5節
3‐ 5…
フ ミヅ キ タ ケ 由来 の 植 物 成 長 調 節 物 質 の 合 成
l Agrocybyne Aの 合 成
Step l:swern酸 化
‐
78° C条 件下、28 mLの ジクロロメタン
(無 水)に (COcI)2(3.51g,27.6 mnol)を 加えた
後、40 mLの
DMSO(無 水)(4.40g,56
‐
60° Cで 30分 間撹拌 した後、再び
水)で 溶解 した
2‐
4 nllnc11)を
_60°
Cを 越えない様 にゆっくり滴下 した。
Cに した。さ らに、38 mLの ジクロロメタン (無
hcxyn_1_Ol(13)(1.80g,18.4 mlnoDを -50° Cを 越えな い様 にゆっくり滴
-78°
下 した。‐
50° Cで 1時 間撹拌 した後、50
(137g,135 nllnol)を
-40°
mLの ジクロロメタン
(無 水)で 溶解 した Et3N
Cを 越えない様 にゆっくり滴下 した。‐
50° Cか らゆっくり室温に
上 げて 1日 間撹拌 した後、低温で減圧濃縮 し、hcx
2‐ ynd(lb)を
HttИ
´
得た
(SchCllle l)。
th印
la
Scheme l.Swern oxidation of hex‐
lb
2‐
ynai(lb).
Step 2:Corey‐ Fuchs反 応
0°
C条 件下、 100
mLの ジクロロメタ ン
73 6 1nllloDを 順 に加 えて
hcx-2‐ ynal(lb)を
(無 水)に cB● (12.2g,36.8 mmol)、
15分 間撹拌 した後 、50 mLの ジク ロロメタ ン
PPh3(193g,
(無 水 )で 溶解 した
ゆっくり滴下 した。oocか らゆっくり室温に上 げて 1日 間撹拌 した後、
50 mLの 水 を押 えて反応を停止させた。水
(3回 )、 飽和 食塩水 (3回 )の 順で有機相 を分液・
洗浄 した後、硫 酸マ グネシウムで乾燥させ、低温で減圧濃縮 し、シ リカゲルのカラム ク ロ
マ トグラフィー (siliCa gc1 60N,50g,50φ ×50
nllll;″ _hexane)に
よ り (1,1_dlbrOmOhep●
1_en―
3-ync)(lC)を 精製 した。さらに、_78℃ 条件下、 150 mLの テ トラヒ ドロフラン
(無 水)に
1,1‐ dbromohept‐ 1-en‐ 3‐
yne(lC)を 加えて lo分 間撹拌 した後 、 14.2 mLの ″―
BuLl(2.36g,
36 8 mmolin″ _hcxane)を ゆっくり滴下 した。-78° Cか らゆっくり室温に上げて
し、さ らに 100gの ドライアイスを加えて
1日 間撹拌
4時 間撹拌 した後、50 mLの 水を加えて反応 を
停止 させた。 lN水 酸化ナ トリウム水溶液 を加えて酢酸エチル (3回 )で 水相を分液 。洗浄
し、さ らに lN塩 酸水溶液を加えてジクロロメタン
(3回 )で 分液 。抽出 した後、硫酸 マ グ
ネシウムで乾燥 させ、低温で減圧濃縮 し、octa_2,4‐ diynoic acid(ld)(790 2 mg,5.81 mmoL
‐62・
orange d,32%)を 得 た (Schme2)。
^ジ01サ
器 レ
´
1●
1●
ld
Scheme 2.Corey‐ Fuchs react:on ofo由 ‐
2,準diynolc ac:d(ld)・
Step 3:メ チル エ ステル 化
0°
C条 件下、60 mLの アセ トンに octa
(241g,174 nlalo)、
24dコ dc aCid(790.2 mg,5 81 mmol)(lo、
K2C03
MeI“ 13g,29 1 1111noDを 順 に加えて撹拌 した。伊Cか らゆっくり室温
に上 げて 1日 間撹拌 した後 、低温で減圧濃縮 した。酢酸エチルで溶解 し、水 (3回
飽和
食塩水 (3回 )の 順で有機相を分液 。洗浄 した後、硫酸 マグネシウムで乾燥させ、低温で減
)、
圧濃縮 し、mcthyl octa 2,4-dlynoate(10(718.4 mg,4 79 1111111ol,ye1low oil,82%)を 得た (Schemc
3)。
Mel,K2CO.
acetono Onc
8296
Scheme 3.Methyiat:on of methyl oda‐ 2,準 diynoate(lo).
Step 4:ア ミ ド化
5伊
C条 件下、 10 mLの ジエテルエー テルで溶 解 した
4 79 1mllolD(lelに
mcthyl oct″ 2,4-dlynoatc(718.4 mg,
10 mTの 25%ア ンモニ ア水溶液 を加 えて撹拌 した。1日 間撹拌 した後 、
凍結乾燥 し、シリカゲル のカラムク ロマ トグラフィー (siliCa ge1 60N,125g,40φ ×200
1mll;
CH2C12/EtOAc 40:60)に より agrOcヵ yne A(1)(38.6 mg,286 μ
mol,WЫ te amOrphous,54%)を
得た (SchCmc 4)。
NH3([:9)
印
, 51 t
5496
le
A9r● cybyne A(1}
Scheme 4. Amination of agrocybyne A (1).
‐63‐
Agrocybyne A" lR (neat, v.o): 1652, 224s,3146 cm-l: 1H NMR (CDC|3): 0.99 (3H, t, 7.2,
H8), 1.5S (2H, m, H7), 2.3O (2H,t,7.2,H6);13C NMR (CDCts): 13.5 (CS), 21.4 (C7)",21.5
(cGF, 63.8 (cqb,
67
.2 (c4b, 71 .a (C3f , 87.4 (cs), 1s4.2 (c1); HRESTMS mtz 1s1.os6o
lM+Nal. (calcd for CsHsNNaO, 15S.0582).
"'b lnterchangeable between the same letter.
2-5-2 Agrocybyne
B
{/a-6ll,
Step l:Corey Fuchs反 応
伊C条 件下 、 100
mLの ジ ク ロロ メタ ン
80.Om■ 01)を 順 に加 えて
(無 水 )に CBr4(13.3g,40 0 nlmol)、
15分 間撹拌 した後 、50 mLの
PPh3(210g,
ジク ロロ メタ ン (無 水 )で 溶解 した
O hex‐ 2-cllal(2a)o.Og,20 0 1nIIlol)を ゆっくり滴下 した。0℃ か らゆっくり室温に上げて
1日 間撹拌 した後、50 mTの 水 を加えて反応を停止させた。水
(3回 )、 飽和食塩水 (3回 )の
順 で有機相を分液・ 洗浄 した後、硫酸 マ グネシウムで乾燥させ、低温で減圧濃縮 し、シリ
カゲルのカラムク ロマ トグラフィー (sliCa ge1 6KIN,50g,50 φX 50 11ml;″ hcxane)に より
0-1,1-dibromohept■ 1,3-dlene ob)を 精製 した。さらに、-78℃ 条件下、150
mLの テ トラヒ
ドロフラン (無 水)に o-1,1-dlbromohcpt″ 1,3-dlene(2b)を 加えて 10分 間撹拌 した後、
16 6 1nIの ″BuLl(256g,40 nllnol h″ hexancmを ゆっくり滴下 した。
‐
78℃ からゆっくり室
温に上げて 1日 間撹拌 し、さ らに
100gの ドライアイスを加えて 4時 間撹拌 した後、50
mLの 水を加えて反応 を停止 させた。 lN水 酸化ナ トリウム水溶液を加えて酢酸 エテル (3
回)で 水相を分液・洗浄 し、さらに lN塩 酸水溶液を加えてジクロロメタン (3回 )で 分液・
抽出した後、硫酸 マグネシウムで乾燥 させ、低温で減圧濃縮 し、o― oC● 4ell-2‐ ynoic ttid oc)
00g,14 5 mmol,clrange o■
,73%)を 得た
(Scheme 5)。
へ器 レ nl群 を メ
一
2a
2b
SCheme 5.Core■ Fuchs reaction of(n‐ 。Ct‐ 4en2‐ ynolc
Step 2:メ チルエステル化
0°
C条
件 下 、 60
(6.Og,43 5 11mloD、
mLの ア セ
acid f2c).
‐
ト ン に o_Oct 4-ell-2興
dc¨ id●
0 3 14 5 1mlloD(2b)、
K2C03
MeI(10.3g,725 mmDを 順 に加えて撹拌 した。0℃ からゆっくり室温に
-64‐
上げて 1日 間撹拌 した後、低温で減圧濃縮 した。酢酸エチルで溶解 し、水 (3回
)、
飽和食
塩水 (3回 )の 順で有機相を分液・洗浄 した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、低温で減圧
濃縮 し、o‐ mCttyl
oc● 4-e■ 2-ynoate(2dl(176g,H6皿 nol,yellow oil,80%)を
得た (Schme
6)。
OH
M● :,К 2Co=
acetone.0"0
61%
Scheme 6.Methyiation of(■ ・methyl oct・ 準en‐ 2‐ ynoate(2d).
Step 3:ア ミ ド化
50°
C条 件下、10
mLの ジエチルエーテルで溶解 した
(D‐ metyl oct‐
4‐ cn‐
2-ynoate(177g,
H6nllnol)(2oに 10 mLの 25%ア ンモニア水溶液 を加えて撹拌 した。1日 間撹拌 した後、
凍結乾燥 し、シリカゲルのカラムクロマ トグラフィー (siliCa gc1 60N,125g,40 ψX 200 mm;
CH2C12/EtOAc 40:60)￨こ よ りagrOcybync B(2)(617.2 mg,4 51 111mcll,white amoThOus,39%)を
得た
(schelne 7)。
o/
NH,(1lo,
Et2● .51● C
31%
2d
Agrocybyne B (2)
Scheme 7. Amination of agrocybyne B (2).
Agrocybyne.B. lR (neat, v,",): 1658, 2197,3166 cm-1; lH NMR (CDC|3):
O.9O (3H,
t,7.2,
H8), 1.41 (2H, m, H7),2.10(2H, m, H6),5.51 (1H, d, 16.1, H4),6.40 (1H, ddd, 16.o,7.2,7.2,
H5); 13C NMR (CDC|3): 13.6 (CS), 21.6 (C7),35.4 (C6), 81.2 (C2),85.5 (C3), 107.4 (C4),
151.2(C5), 155.8(Cl); HRESIMS m12160.0768 [M+Na]i(calcdforCgHsNNaO, 160.0738).
‐65‐
第
2部
ヨフキサル ノコシカケ (a“ θルr“ α″μttα 勧 )に
“
由来す る抗 口腔内細菌活性物質 の探索
:
￢
・
[「
‐66‐
第
1章
緒論
現在、高齢化社会 の進行 に伴 い、人々の健康 に対す る関心が高まって いる。なかでも食
生活 は高齢化社会における人々の :QOL(■ diサ OflfC)を 支える重要な要素であ り、そのた
めには歯や 口腔内の健康 の維持が必要である。 う蝕や歯周病 といった慢性変性歯科疾患は
感染病原因子
(口
腔内細菌
)、
宿主 因子 (生 体防御機構
)、
環境因子 (生 活習慣)等 の相互作
用が原因とされてお り、特 に、日腔内細菌 によって 引き起 こされる疾病は広範 囲にわたっ
て人々に存在するため、公衆衛 生上において重要な問題である
1。
ヒ トの口腔内には 400種
もの菌種 、 100億 を超す数 の細菌が生息 してお り、 これ らの細菌は舌背、歯表面、歯 肉溝
等でバイオ フィルムやデンタルプラー ク (歯 垢)が 形成 される。その中で歯周病 の原因とさ
れ る代表的な病原菌は
″滋 ″ ″″ο
ル魏 ″,乃 ψゎ
ο″
お gJ2g′ ″加,PJ″ 渤物´
″α
““
“
Иο
″ο
みα
ο
′
′
′
な αο
あ″zッο
教笏ο
ο
″滋お,■ ″″〃 Jaヵ rsy励 ´
″
Sお 等であ り、これ らの病原菌によっ
Fttο み
,
て全 身性疾患にまで発展する危険性 もある
2,3。
特 に、グラム陰性偏性嫌気性菌である
F
″
″ο
ル磁 ″ は歯周病の主要な病原菌であり4,5、 世界人 口の 5-15%の ヒ トに疾病 を引き起 こ
している 6。 E″ ″
。
姥魏
には口腔内のパイオ フィルムの中で他 の菌種 と凝集体 を形成する
“
能力をもち、 この作用 によって慢性変性歯科疾患が発症または促進される 4,740。 従って、
F″ ″οル滅初 の生育 を抑制 させることは慢性変性歯科疾患 の予防 または治療す ることにお
いて効果的である。
歯周病 の予防・ 治療 として、デンタルプラー クの除去や抗菌薬 の投与 による口腔内細菌
の除去が主に一般的 に行われている。抗菌薬 による治療法 において、バ イオ フィルムを形
成 した細菌 の抵抗性は遊離する細菌のそれ と比較 して
1000‐ 1500倍 高 いと言われてお り
・
、
抗菌薬 のみの投与 では病原菌 を死滅 させることは困難であるとされて いる。 しか し、バイ
オフィルムを破壊 した部位 に抗菌薬を投与する等、物理的治療法 と化学的治療法を併用す
ることで効果的な治療ができると期待 されている。近年、抗菌薬を併用 した歯周病 の治療
に関する様々な研究がなされてお り、抗菌薬 の有効性 も報告されて いる °。一方、抗菌薬 と
して chlorhexidiЮ や
cipr。 ■oxacin,metroddazole,nllnocycline,pcnicillhs等
の使用が試み
られているが、副作用が強 いことや、耐性菌 の存在 も確認 されてお り、長期間 にわたる使
用は困難 とされている (Fig.1)・
・
5。
従って、疾病 の予防には病原菌 の生育 を抑制 し、 日腔
内の環境 を正常 に維持す ることが重要である。そのため、病原菌 の殺菌・ 制菌 に有効な物
質 の探索 と開発は、慢性変性歯科疾患 とそれに起因す る全身性疾患の予防 と治療 に大 いに
役立つ可能性がある。
そ こで、慢性変性歯科疾患 に関与する様 々な病原菌に対 して抗 口腔内細菌活性 のスクリ
67‐
Hナf
Chlorhexidine
Ciprotloxacin
Metronidazole
∽ 乃
Peni● ‖
‖
n
Minocycllne
Fig.
l. Chemical structures of antlblotlc drugs.
―ニ ングを行 ったところ、コフキサル ノコシカケ
滋
(Gα ″
ο
ル滅″ に対す る抗細菌活性が確認 された。
物 に F″ ″
卿α″μ α″ )に 由来する抽出
“ “
コフキサル ノコシカケは世界中に生息 している薬用 のキ ノコである。 このキノコは森林
中の樹木を腐 らせる木材腐朽菌である。主に漢方薬や健康食品 として利用 されてお り、抗
glucanを 含有 していることが報告 されている '′ 。 この様な薬理活
腫瘍活性物質 として β―
“
性 の高さか ら、日腔内の抗細菌作用だけでな く、その環境を正常に維持す る調節作用 も期
待 される。以上よ り、本研究では、 コフキサル ノコシカケに由来す る抗 口腔内細菌活性物
質 の単離・ 精製および構造解析を目的とした。
68‐
第
第
1節
2章
本論
コ フキサ ル ノ コ シカ ケ 由来 の 抗 口腔 内細 菌 活 性 物 質 の 単 離 ・ 精 製
コフキサル ノコシカケの種菌 をポテ トデキス トロー ス液体培地 に移植 して
4週 間培養
を行 った。その後、ろ過 によって菌糸体 と培養ろ液 に分離 した。菌糸体は凍結乾燥後 破砕
し、″_ヘ キサン、酢酸エチル、エタノール、水で順次浸漬抽出を行 い、″―
ヘキサ ン可溶部、
ヘキサ
酢酸エテル可溶部、エタノール可溶部、水可溶部 を得た。培養 ろ液は減圧濃縮後、′‐
ヘキサ ン可溶部、酢酸エチル可
ン、酢酸エチル、エ タノール、水で順次浸漬抽出を行 い、″―
溶部、エ タノール可溶部、水可溶部 を得た。得 られた各画分について抗 口腔内細菌活性試
ヘキサ ン可溶部、酢酸エチル可溶部に顕著な F″″
験を行ったところ、培養 ろ液の ″―
ο
ル磁 〃
に対する抗細菌活性が確認された
cablC l)。
Table l.Antibiotic efFect oftho oach fraction from C appranartrm on the grou■ h of員
″″crearam.
MIC(ppm)a
Fraction
n-hexane
EtOAc
(mycelia)
400
25b
Fraction n-hexane
(culture broth) < 3.1
EtOAc
a Minimum inhibitory∞
EtOH
H20
０
Ｔ
Positive control
H20
０
０
﹁２
く6.3
EtOH
ncentration.
b Growth suppression.
そ こで、 この活性試験 の結果 を指標 にしなが ら各種 ク ロマ トグラフィー による分画 を行
った。培養 ろ液の酢酸エチル可溶部 をシリカゲルのフラッシュカ ラムク ロマ トグラフィー
によ り 13画 分 に分画 した。画分
によ り
8は ODSゲ ルのフラッシュカラムクロマ トグラフィー
50%MoOH溶 出部 と MeoH溶 出部 の 2画 分 に分画 し、さらに、画分
HPLCに よ り 12画 分 に分画 した。さらに、画分
を単離 した。画分
HPLCに よって化合物
6
9は シリカゲルのフラッシュカラムク ロマ トグラフィー によ り 15画 分
に分画 し、さらに、画分
した。また、画分
8-1-8か ら逆相
8-1は 逆相
9‐
9‐ 2,9‐
5は 逆相
HPLCに よって化合物 1-4を それぞれ単離
HPLCに よ り 9画 分 に分画 し、さらに、画分 9-54か ら逆
3,9-4か ら逆相
‐69・
相
HPLCに よって化合物
5 を単離 した
(Fig。 2)。
呻
「
C.appranary“
EtOA,so:uble part(15.5g)
Flash C.C.(si:iCa ge:60N)
CH2C12/EtOAc=90/10,70/30,50/50,
EtOAc′ MeOH=100/0,50ノ 50,0′ 100
F:ash C.C.(ODS ge:Cosmosi1 140C18‐
MeOH/H20=50/50,100/0
OPN)
F:ash C.C.(siliCa gei 60 N)
CH2C12 /aCetone=100/0, 95/5, 90/10,
80′ 20,60′ 40,30ノ 70,
acetoneノ い
ИeOH
1
=100ノ 0150/50,0/100
1r.a e)
15
RP‐ HPLC(Develos‖ C30¨ UC‐ 15′ 30)
MeOH′ H20・ 50/50,100/0
8(50。
「
…
7 mg)
12
剛:潔 :〉 :」8=詰 尾 [:罵群 :5)
compound 6(31 8 mg)
RP‐ HPLC(Deveiosi:c30‐ UG‐ 5)
RP‐ HPLC(Develos‖ C30‐ UG‐ 5}
MeOH/H20=60′ 40,100/0
MeOHノ H20・ 60/401100/0
comp0und 1 ta.o msr
COmpOUnd 4 (r.z
cOmpound 2 ts.o msl
compoUnd 4 (r.o ms)
rng)
RP‐ HPLC(CAPCELL
PAK C18 AQ)
M00H/H20=70/30,100ノ 0
RP‐ HPLC{Deveiosi!c30‐ UG‐ 5)
MeOHノ H20=60ノ 40,100/0
compound 3(2.3 mg)
1
4
(s.o
l-I
ms)
I
compound 5 tz.o msr
Flg.2. Purification procedure of culture broth of G applanatum.
70‐
9
ne-ner-c (cAPcELL PAK cisAo)
MeOH lHrO= 50/50, 100/0
2節
第
コ フ キ サ ル ノ コ シカ ケ 由来 の 抗 口腔 内細 菌 活 性 物 質 の 構 造 解 析
ヨフキサル ノコシカケの培養ろ液 の酢酸 エチル可溶部か ら単離 した各化合物について、
各種機器分析による構造解析 を行 った。
2‐ 2‐
1化 合 物 1の 構 造 解 析
化合物
1は 無色油状物質 として単離 された。HR― ESIMSに お いて を301。 1761[M+Na]+
“
(CalCd fOr crH26Na03,301.1780)の 分子イオンピー クが観測 され、分子式を C17H2603と 決定
した
(Fig。 4)。
13c_NMR、
炭 素が
IRに お い て
DEPT、
HMQCに
3460 cm‐
1(OH)に
よ り、 メ チ ル が
6つ 存在 す る ことが 明 らか にな った
COSYの 相 関
(Hl'/H2')、
C2')お よび 化 学 シ フ トの値
(δ H 3。
5つ 、 メ チ
(Fig。
6‐
レ ンが
4つ
、メ チ ン が
NMR、
2つ 、4級
9,Table 2)。 化 学 シ フ トの値
(δ c
125。
1,
よ り、 ベ ンゼ ン骨 格 を部 分構 造 に もつ ことが 示唆 され た
133。 7,134.7,135。 3,138.5,140.8)に
(Table 2)。
lH‐
吸 収 ピ ー ク が 観 測 さ れ た (Fig.5)。
HMBCの
相 関 (Hl'/C2';H2'/Cl',C2'― OCH3;C2'¨ OCH3/
36,3.42;δ c 58.6,71.4)に よ り、メ トキ シエチル の 部 分構造
を決定 し、HMBcの 相 関 (C4-CH3/C3a,C4,C5;C6… CH3/C5,C6,C7;H7/C5,C6… CH3;H17C4,
C5,C6)に よ り、 メ トキ シ エ チル と 2つ の メチル が ベ ンゼ ン骨 格 に接続 す る こと を解 明 し
た (Fig。 3,10,H,Table 2)。 さ らに、HMBCの 本目関 (H1/Cl¨ OCH3,C2,C2‐ CH3,C2-CH20H,C3,
C3a,C7;Cl― OCH3/Cl;C2‐ CH3/Cl,C2,C2-CH20H,C3;C2-CH20H/Cl,C2,C2-CH3,C3;H3/Cl,
C2,C2-CH3,C2¨ CH20H,C3a,C4,C7a;H7/Cl,C3a)お よび化学 シフ トの値
3.76;δ c 57。 2,68。 2)に
(δ
H 3.42,3.63,
よ り、(2‐ メ トキ シー
1‐ メチル シクロベ ンチル
)メ タ ノー ルの部分構造 を決
定 し、NOEの 相関 (H1/C2¨ CH3)に よ り相対 立体配置 を決定 した
(Fig。
3,H,12,Table 2)。 以
上 によ り、 化 合物 1 を ((lS*,2S*)‐ 1-methoxy‐ 5-(2-methoxyethyl)-2,4,6¨
t五 methyl-2,3-dihydro…
lμ inden¨ 2… yl)methanolと 決定 した。化合物
た (Fig。
1は 新規化合物 であ り、applanatine
13)。
Fig.3.COSY and HMBC correlations in l.
'7t'
Aと 命名 し
強度 (30401)
Fig. 4. ESIMS (+) spectrum of 1.
100
80
:
60
3460 cnTl
(OH}
%T
40
20
0
4000
3000
2000
WavenumberlcmⅢ
Fig. 5. lR spectrum of 1.
‐72‐
400
ll
/
OCH.
︲
︱︱︲Ｉ
＼
ＵＮＪ
叫
う
2'‐
4・CH。
2・ CH。
ｒ掛
Fig. 6. rH NMR spectrum of
I
(in GDCI3).
n
I
(in CDCIr).
i15
Fig. 8. DEPT spectrum of
1
I
(in CDCI3).
‐73‐
Ｃ
n
2‐ CH20H
＼
Ｈ
2
2‐ CH.
/
OCH.
Ｏ
1・
酬レ
Fig. 7. r3C NMR spectrum of
1‐
OCH3
2'
6‐
CH,
z'.ocH,
4‐ CH3
/
\
1'
4‐
CH3
6‐
CH3
2(H3
‐
1'
3-
―
21‐
OCH3
2・
‐
OCH3
CH20H
,「
Fig. 9. HMQC spectrum of 1 (in CDCI3).
1‐
OCH,
2・
1
6-CH3
2'‐
z-cHroH
OCH3
1'
＼
4‐
CH3
6‐ CH,、
●
3
ガ
∬
:￨_瀞
1:耽
・
li
f'/
1 -
7 -
Fig. 10. COSY spectrum of 1 (in CDCI3).
' 74'
￨
.●
2‐ CH3
＼
２
ヽ
卿
叫
2・
´
4-CH3
6‐
CH3
2-CH; -
-
1'
3 -
―
2 -
't-ocH3
}'-OCH,
\
-/
rCH20H
ろ
＼
一
Fig.11.HMBc spectrurrl of l(in CDC13)・
ヽ、
、
。
///OH
Fig. 12. NOE difference experiment of 1 (in CDCI3).
‐75・
6‐
CH3
‐
OCH,
'
Table 2. rH and r3C NMR data for 1 (in CDGI3).
Positlon
lH
6 (multiplicity, J in Hz)
4.25(s)
1
13c
HMBc
δ
lH t。 13c
93.8
2,3,3a,7,1‐ OCH3,2‐ CH3,2‐ CH20H
476
2
2.34(d,159)
3
39.2
l,2,3a,4,7a,2‐ CH3,2‐ CH20H
322(d,159)
3a
140.8
4
1337
1353
1347
5
6
700(s)
7
1251
1,3a,5,6‐ CH3
1385
7a
l‐
OCH3
3.42(s)
57.2
1
2‐
CH3
100(S)
237
1,2,3,2‐ CH20H
2‐
CH20H
363(d,116)
68.2
l,2,3,2-CH3
3a,4,5
376(d,11.6)
1'
295(t,79)
2'
3.42(t,79)
158
204
301
714
336(s)
58.6
4-CH3
222(s)
CH3
234(s)
6‐
2'‐
OCH3
Fig.13.Applanatine A(1).
・ 76‐
5,6,7
4,5,6,2'
5,1',2'‐
2'
OCH3
2‐
2-2化 合 物 2の 構 造 解 析
化合物
2は 無色油状物質 として単離 された。HR‐ ESIMSに おいて
4/z301。
1763[M+Na]+
(CalCd fOr c17H26Na03,301.1780)の 分子イオ ンピー クが観測 され、分子式 を C17H2603と 決定
した
(Fig。 15)。
13c_NMR、
炭 素が
IRに お い て 3457 cm 1(OH)に
DEPT、
HMQCに
フ トの値
(δ
(Fig。 16)。
lH‐
NMR、
5つ 、メ チ レ ン が 4つ 、メ チ ン が 2つ 、4級
よ り、 メ チ ル が
6つ 存在 す る ことが 明 らか にな った
比 較 によ り、 化 合 物
吸 収 ピー ク が 観 測 され た
17¨ 20,Table
(Fig。
各種 ス ペ ク トル デ ー タ の
3)。
2は 化 合 物 1の ジ アス テ レオ マー で あ る ことが示 唆 され た。 化 学 シ
c 124.6,133.0,134.6,135。 1,138.6,139。 9)に よ り、ベ ンゼ ン骨 格 を部 分構 造 に もつ
ことが 示 唆 され た
C2'¨ OCH3;C2'―
(Table 3)。
COSYの 相 関
(Hl'/H2')、
OCH3/C2')お よび化学 シフ トの値
キ シ エ チ ル の 部 分 構 造 を 決 定 し 、 HMBCの
相関
(δ
HMBCの
H 3.35,3.40;δ c
(Fig。
58。 6,71.4)に
よ り、メ ト
(C4-CH3/C3a,C4,C5;C6‐ CH3/C5,C6,C7;
H7/C5,C6‐ CH3;H17C4,C5,C6)に よ り、 メ トキ シ エ チ ル と
接 続 す る こ と を解 明 した
相 関 (Hl'/C2';H2'/Cl',
2つ の メ チ ル が ベ ン ゼ ン 骨 格 に
14,21,22,Table 3)。 さ ら に 、HMBCの
相 関 (H1/Cl‐ OCH3,C2,
C2-CH3,C2¨ CH20H,C3,C3a,C7;Cl― OCH3/Cl;C2-CH3/Cl,C2,C2‐ CH20H,C3;C2中CH20H/Cl,
C2,C2-CH3,C3;H3/Cl,C2,C2… CH3,C2‐ CH20H,C3a;H7/Cl,C3a)お よび化学 シフ トの値
(δ
H
3.47,3.49,3.50;δ c 58.4,69.8)に よ り、(2… メ トキ シー
1-メ チル シク ロペ ンチル )メ タ ノー ル の部
分構造 を決定 し、NOEの 相 関
22,23,Table 3)。
(Cl― OCH3/C2-CH3)に
以 上 によ り、 化合物
trimethyl-2,3… dihydro¨
2を
よ り相対 立 体配置 を決定 した
14,
((lR*,2S*)‐ 1-methoxy-5… (2-methoxyethyl)‐ 2,4,6…
lμ inden-2-yl)methanolと 決定 した。 化合物
applanatine Bと 命名 した
(Fig。
(Fig。 24)。
Fig.14.COSY and HMBC correlations in 2.
‐77‐
2は 新規化 合物 で あ り、
IM+Nal・
301.24040
216. t 94m274.3,1{70
質量電荷比(m/2)
Fig. 15. ESIMS (+) spectrum ot 2.
108
100
90
%T
l
80
3457 cn丁
1
(OH)
70
65
4000
3000
2000
Wavenumbericm・
Fig.16.:R spectrurro of 2.
‐78‐
1000
1:
2',OCH}
1-OCHi
鴫 人
“／
１１１１１１１１１ト
CH20H
2‐
2.CH?
ｒ ｉ ヨ ー
７
Ｖ ● １１
Ｓ
Fig. 17. 1H NMR spectrum of 2 (in CDCI3).
1
tl
6CHo 2-CHe
sdv z' zcH2oH 2'ocH3
３
1-OCH3
／
2
●
Fig. 18. r3C NMR spectrum of 2 (in CDCI3).
21‐
OCH.
1-OCH3
2'
●
Fig. 19. DEPT spectrum of 2 (ln CDCI3).
79‐
21H2OH
6‐ CH。
2.CH3
4€H3
OCH3
＼
1 2‐
CH20H
2・
‐
OCH3
/1iふ
銀＼
∝／
1‐
Fig.20.HMQC spectrum of2(in CDC13)・
＼
7 -
Fig.21.COSY spectrum of2(in CDCi3)・
‐80‐
2'‐
OCH3
/11‐
ゝ
３＼
Ｈ
Ｃ
OCH3
Ｃ
．
４
／
1‐
OCH,
1‐
1 2‐ CH20H
ヽヽ
;:ノ
Fig.22.HMBC spectrurrl of 2(in CDCi3)・
1口
OCH3
Fig. 23. NOE difference experiment of 2 (in CDCI3).
‐81‐
2'・
OCH3
/“ t
1' 3
2‐
4‐
CH3
CH3
ヽ
Table 3. rH and r3C NMR data for 2 (in CDCI3),
Ｃ δ
Position
lH
6 (multiplicity, J in Hz)
439(s)
1
880
HMBC
lH t。
13c
2,3,3a,7,1‐ OCH3,2-CH3
491
2
262(d,159)
3
40.3
l,2,3a,2‐ CH3 2‐ CH20H
266(d,15.9)
3a
138.6
4
1330
1346
1351
5
6
7
701← )
1246
1399
7a
1,3a,5,6‐ CH3
l‐
OCH3
3.49(s)
58.4
2‐
CH3
1 12(s)
1,2,3,2‐ CH20H
2‐
CH20H
347(d,107)
176
698
CH3
6‐ CH3
350(d,107)
218(s)
232(s)
156
203
3a,4,5
1'
293(t,81)
29.9
4,5,6,2'
2'
340(t,81)
714
5,1',2■ OCH3
3.35(s)
58.6
2'
4‐
2■
OCH3
Fig. 24. Applanatine B (2).
‐82‐
1
l,2,3,2‐ CH3
5,6,7
2-CH20H
2‐ 2‐
3化 合 物 3の 構 造 解 析
化合物
3は 無色油状物質 として単離 された。HR― ESIMSに お いて
(CalCd fOr c17H26Na03,301。
した
(Fig。 26)。
13c_NMR、
炭 素が
HMQCに
よ り、 メ チ ル が
6つ 存在 す る ことが 明 らか にな った
比較 によ り、 化 合物
の値
1780)の 分子イオ ンピー クが観測 され、分子式を C17H2603と 決定
IRに お い て 3421 cm 1(OH)に
DEPT、
(δ c
124。 7,133。
が示 唆 され た
a/z301。 1780[M+Na]十
吸 収 ピー ク が 観 測 され た
5つ 、 メ チ
レ ンが
(Fig。 28¨ 31,Table
4つ
4)。
(Fig。 27)。
、メ チ ンが
lH―
NMR、
2つ 、4級
各種 ス ペ ク トル デ ー タ の
3は 化 合物 1,2の 構 造 異性体 で あ る ことが示 唆 され た。 化 学 シ フ ト
2,135.5,138.3,140。 9,142.3)に よ り、ベ ンゼ ン骨 格 を 部分構造 に もつ こと
(Table 4)。
COSYの 相 関
(Hl'/H2')、
OCH3;C2'― OCH3/C2')お よび 化学 シフ トの 値
エ チル の 部 分構 造 を 決定 し、 HMBCの 相 関
(δ
HMBCの
H 3.28,3.57;δ c
相 関 (Hl'/C2';H2'/Cl',C2'¨
58。 8,71.8)に
よ り、 メ トキ シ
(C4-CH3/C3a,C4,C5;C6-CH20H/C5,C6,C7;
H7/C5,C6¨ CH20H;H17C4,C5,C6)お よび 化 学 シフ トの値
(δ H 4。
56,4。 62;δ c 64。 1)に
よ り、メ
トキ シエ チル 、 メチル 、 ヒ ドロキ シ メチ ル がそ れぞ れ ベ ンゼ ン骨 格 に接 続 す る こと を解 明
した (Fig。 25,32,33,Table 4)。
さ らに、HMBCの 本目関 (H1/Cl‐ OCH3,C2,C2¨ CH3a,C2-CH3b,
C3,C3a,C7;Cl… OCH3/Cl;C2‐ CH3a/Cl,C2,C3,C2… CH3b;C2‐ CH3b/Cl,C2,C3,C2-CH3a;H3/Cl,
C2,C2‐ CH3a,C2-CH3b,C3a,C4,C7a;H7/Cl,C3a)お よび 化 学 シ フ トの値
(δ
H 3.46;δ c 58.0)
によ り、2-メ トキ シー
1,1‐ ジ メチル シク ロベ ンタ ンの 部 分構造 を 決定 し、全 平面構 造 を 決定 し
た
(Fig。
25,33,Table 4)。 以 上 によ り、 化 合 物
3を
(1… methOXy-5¨ (2¨ methoxyethyl)-2,2,4-t五
methyl-2,3‐ dihydЮ …
lμ inden‐ 6-yl)methanolと 決 定 した 。 化 合 物
applanatine Cと 命 名 した
(Fig。 34)。
Fig.25.COSY and HMBC correlations in 3.
‐83‐
3は 新 規 化 合 物 で あ り、
強度 (:48379)
Fig. 26. ESIMS (+) spectrum of 3.
５
０
０
０
3421 cnTl
%T
(OH)
60
50
4000
3000
2000
Wavenumberlcm・
Flg.27.lR spectrum of 3.
‐84‐
400
ll
￨
2‐
CH.
Fig. 28. 1H NMR spectrum of 3 (in CDCI3).
:
2'‐
Solv
●CH.
1-OCH.
＼
2'
3
︲
７
﹁
＼12
●
Fig. 29, 13C NMR spectrum of 3 (in CDGI3).
Fig. 30. DEPT spectrum of 3 (in CDC[).
‐85‐
1,2,3
Ｃ
４
．
／
Ｃ
．
４
／
３
Ｈ
３＼
Ｈ
Ｃ
３ ３∧
Ｈ
Ｃ
３
３∧
Ｈ
Ｃ
¨／ ｒ‘
／
２
¨／ ｒ‘
／
4-CH3
24H3
<
-
1'./
2
3
-_.__
1-OCH3
Z'-ocH, ----
6-CH2OH
2.-
-
Fig. 31. HMQC spectrum of 3 (in CDCI3).
7-
Fig. 32. COSY spectrum of 3 (in CDCI3).
‐86‐
３
Ｈ
-
２
6-CH?OH
1'
＜
才
３
Ｈ
4‐
CH3
2_
3
1‐
OCH3 OCH3
CH20H
2'¨
6‐
2'
一
1 -
:ミ
67a
3a
―
Fig。
33.HMBC spectruFFa Of 3(in CDCi3)・
‐87‐
３∧
/
Table 4, 1H and r3C NMR data for 3 (in CDCIg).
Ｃ δ
Posit:on
lH
δ(mu‖ plicity,」 in Hzl
1
IH t。
13c
411(s)
923
438
2,3,3a,7,1‐ OCH3,2‐ CH3a,2‐ CH3b
251(d,15.6)
451
l,2,3a,4,7a,2‐ CH3a,2‐ CH3b
2
3
HMBC
275(d,156)
3a
142.3
4
1332
5
135.5
6
l‐
OCH3
3.46(s)
1383
1247
1409
580
2‐
CH3a
111(S)
22.3
l,2,3,2‐ CH3b
2‐
CH3b
111(S)
l,2,3,2‐ CH3a
217(s)
282
158
3a,4,5
4.56(d,11.9)
641
5,6,7
719(s)
7
7a
4-CH3
6‐
CH20H
1,3a,5,6-CH20H
1
462(d,119)
l:
303(t,5.5)
296
4,5,6,2'
2'
357(t,55)
71.8
5,1',2■ OCH3
328(s)
588
2'
2■
OCH3
Fig.34.Applanatine C(3).
・ 88‐
2‐ 2‐
4化 合 物 4の 構 造 解 析
化合物
4は 無色油状物質 として単離された。HRttESIMSに お いて
4/z303。
1619[M+H]+
(CalCd fOr c18H2304,303.1596)の 分子イオ ンピー クが観測 され、分子式 を C18H2204と 決定 し
た
(Fig。 36)。
13c_NMR、
炭 素が
IRに お い て 1718 cm 1(C=0)に
DEPT、
HMQCに
よ り、 メ チ ル が
8つ 存在す る ことが 明 らか にな った
125。 7,131.9,138.8,140。
(Table 5)。
(Fig。 37)。
lH‐
4つ
、メ チ レ ン が
(Fig。
38-41,Table 5)。 化 学 シ フ トの 値
4つ
、メ チ ンが
NMR、
2つ 、4級
124。 3,
(δ c
8,150.0)に よ り、 ベ ンゼ ン骨 格 を部 分構 造 に もつ ことが示 唆 され た
COSYの 相 関
HH/Cl,C4→
吸 収 ピー ク が 観 測 され た
(H3/H4)、
HMBCの
相関
(H3/Cl,C4,C4a;H4/C3,C4a,C5,CH%
、 IRの 吸 収 ピ ー ク (1718 cm・ )お よ び 化 学 シ フ ト の 値
(δ
H 2.95,4.47;δ c
25。 3,
66.5,165,7)に よ り、δ‐ラ ク トン の 部 分 構 造 と ベ ンゼ ン骨 格 との 接 続 を 決 定 し、HMBcの 相
関 (C5-CH3/4a,5,5→
に よ り、メ チ ル が ベ ンゼ ン骨 格 に 接 続 す る こ と を 解 明 した
42,43,Table 5)。 さ ら に 、HMBCの 本目関 (H6/C5,C5a,C6a,C6a‐
(Fig。
35,37,
CH3,C7,C10a,C10b;C6a… CH3/
C6,C6a,C7,C10a;H7/C6,C6a,C6a¨ CH3,C9,C10a;C9¨ CH3a/C9,C9¨ CH3b;C9中 CH3b/C9,C9CH3a;H10a/C5a,C6,C6a,C6a… CH3,C9,C10b,CH;HH/C5a,C10a)お よ び 化 学 シ フ トの 値
(δ H
3。 77,3.81;δ c 66。
8,98。
1)に よ り、2,2,4a― トリメチル ヘ キサ ハ イ ドロシク ロベ ンタ ロ [1,3]
ジオキ シンの部分構造 を決定 し、NOEの 相 関 (H10a/C6a― CH3)に よ り相対 立 体配置 を決定
した
(Fig。
35,43,44,Table 5)。
以 上によ り、化合物
3,4,6a,7,9,10a… hexahydrocyclopenta同
物
4を
(6aS*,10パ
*)‐
5,6a,9,9¨ tetramethyl―
[8,10]diOXOnolgliSOChromen-lco― oneと 決定 した。 化合
4は 新規化合物 で あ り、applanatine
Dと 命名 した
Fig.35.COSY and HMBC correlations in 4.
‐89‐
(Fig。 45)。
xro3
tl
IM+Nal・
(152st3)
32521120
80
[M tt Hl+
303.22433
00
40
20
200
400
質量電荷比(m/2)
Fig.36.ESiMS(+)SpeCtrunl of 4.
%T
80
1718 cnTl
(C=0)
60
50
4000
3000
2000
Wavenumberlcm■
Fig. 37. lR spectrum of 4.
‐90‐
1000
1
400
Fig. 38. rH NMR spectrum of 4 (in CDCI3).
9‐
CH.
6
6a
"
Fig. 39. r3C NMR spectrum of 4 (in CDCIa).
Fig, 40. DEPT spectrum of 4 (ln CDCIS).
‐91‐
6●
・ CH.
5・
CH.
8
Fig. 41. HMQC spectrum of 4 (in CDCI3).
Flg. 42. COSY spectrum of 4 (in CDCI3).
‐92‐
３
一
Ｈ
一
一
叫
Ｃ
ａ
５
．醐
６
６
３
７
．
911a
\
11
5- --:
4afib5a
Fig. 43. HMBC spectrum of 4 (in CDCI3).
Fig. M. NOE difference experiment of 4 (in CDCI3).
'93-
Table 5. rH and r3C NMR data for 4 (ln CDCIs).
Ｃ δ
Position
lH
6 (multiplicity, J in Hz)
HMBC
lH t。
13c
ｌ
1657
３
４
66.5
2.95(m)
253
1388
ａ ａ
５
４
５
447(m)
3,4a,5,1la
131.9
６
251(d,162)
338(d,162)
1500
407
5,5a,6a,7,10a,10b,6a‐ CH3
404
6a
377(d,121)
7
1,4,4a
66.8
6,6a,9,10a,6a… CH3
381(d,121)
9
98.1
468(s)
805
1408
5a,6,6a,9,10b,11,6a‐ CH3
801(s)
125.7
1,4a,5a,10a
CH3
221(s)
1243
153
4a,5,5a
CH3
9‐ CH3a
091(S)
22.5
6,6a,7,10a
1 31(s)
281
9,9‐ CH3b
9 CH3b
153(s)
204
9,9‐ CH3a
10a
10b
ll
lla
5‐
6a‐
Fig.45.Appianatine D(4).
‐94‐
2‐ 2‐
5化 合 物 5の 構 造 解 析
化合物
5は 無色油状物質 として単離 された。HR‐ ESIMSに お いて
(CalCd fOr c15H18Na04,285。
した
た
(Fig。 47)。
(Fig。 48)。
メチンが
1703(C=0)、 3400 cm・
NMR、 13c_NMR、 DEPT、 HMQCに
(OH)に そ れ ぞ れ 吸 収
よ り 、メ チ リレが
、メ チ レ ン が
(Fig。
49-52,Table 6)。
(δ c
(Table 6)。
相 関 (H3/Cl,C4,C4鶴 H4/C3,C4a,C5,C9■ H9/Cl,C4a)、
2.96,4。 48;δ c 25。 2,66。 7,166.0)に
造 とベ ンゼ ン骨格 との 接続 を決定 し、HMBCの 相 関
ベ ンゼ ン骨格 に接続す る ことを解 明 した
、
各種
124。 3,124.6,131.5,138.5,143。 1,148。 2)
によ り、ベ ンゼ ン骨格 を部分構造 にもつ ことが示唆 された
(δ H
4つ
5は 化合物 4の 9位 のイソプ ロピルをもたな い
類縁体である ことが示唆 された。化学 シフ トの値
Cm 1)お よび 化 学 シ フ トの値
ピー ク が 観 測 され
2つ
2つ 、4級 炭素が 7つ 存在す ることが明 らかになった
スペ ク トルデー タの比較 によ り、化合物
HMBCの
1098[M+Na]+
1103)の 分子イオ ンピー クが観測 され、分子式を C15H1804と 決定
IRに お い て
lH―
4/z285。
(Fig。
COSYの 相関
(H3/H4)、
IRの 吸収 ピー ク
(1703
よ り、δ¨ラク トン の 部 分構
(C5¨ CH3/4a,5,5a)に
46,48,53,54,Table 6)。
よ り、 メチル が
さ らに、 HMBcの 相
関 (H6/C5,C5a,C7,C8,C8a,C7-CH3,C7… CH20H;C7¨ CH3/C6,C7,C8,C7-CH20H;C7-CH20H/
C6,C7,C8,C7-CH3;C8/C5a,C6,C7,C8a,C9,C7-CH3,C7-CH20H;H9/C5a,C8)お よび 化 学 シ
フ トの値
(δ H 3。
72,3。 77,4.89;δ c 68。
1,83.6)に よ り、2¨ (ヒ ドロキ シメチル
)‐ 2‐
メチル シ ク ロペ
NOEの 相 関 (H8/C7… CH3)に よ り相対 立 体 配 置 を決定 した
ンタ ノー ル の 部分構造 を決定 し、
(Fig。
46,54,55,Table 6)。
以 上 によ り、 化 合物
5を
(7S*,8S*)-8¨ hydroxy-7‐ (hydrO狗 methyl)―
5,7-dimethyl… 3,4,7,8-tettahydЮ cyclopentalg]isOChrOmen… 1(6⊃ ‐
oneと 決 定 した。 化 合物
規 化 合物 で あ り、applanatine Eと 命 名 した
COSY
(Fig。 56)。
HMBC
→
一
Fig.46.COSY and HMBC correlations in 5.
‐95‐
5は 新
相対強度
90
80
70
00
40
30
20
10
200
4C
Fig.47.ESiMS(+)SpeCtrunl of 5.
110
100
80
1703 cnTl
%T
(C=0)
60
:
3400 cnl・ 1
{OH)
40
30
4000
3000
2000
WavenumberlcnTll
Fig. 48. lR spectrum of 5.
‐96‐
400
:
5・
￨
CH3
7・ CH。
Fig.49.lH NMR spectrum of5(in CDCi3)・
4 7CH.
7
6
5・
5
Fig. 50. r3C NMR spectrum of 5 (in CDCIa).
7‐
150
125
100
CLO/1ゝ
75
Fig. 51. DEPT spectrum of 5 (in CDCI3).
‐97・
50
25
CH.
３
＼
Ｈ
Ｃ
３
Ｈ ＼
Ｃ
＼
６
54H3
74H1
4
-.
6-
7-
37-CH?OH
/
8-
9
9a-
３
Ｈ ＼
Ｃ
＼
６
Fig. 53. COSY spectrum of 5 (in CDCI3).
-98-
鋤＼
Fig. 52. HMQC spectrum of 5 (in CDCI3).
CHO
4 -
、
6
:J:::,,I「
、
Fig. 54. HMBC spectrum of 5 (in CDCI3).
Fig. 55. NOE difference experiment of 5 (in CDC!3).
‐99‐
喝＼
鋤＼
5-CH3
7‐
Table 6. 1H and 13C NMR data for 5 (in CDCh).
lH
Ｃ δ
Position
6 (multiplicity, J in Hz)
1
448(dd,55,55)
296(dd,55,55)
3
4
1660
667
252
4a
138.5
5
1315
5a
148.2
253(d,168)
6
400
HMBC
lH t。
43c
1,4,4a
3,4a,5,9a
5,5a,7,8,8a,7‐ CH3,7‐ CH20H
313(d,168)
471
7
489(s)
8
8a
836
5a,6,7,8a,9,7‐ CH3,7-CH20H
143.1
802(s)
1246
1243
5-CH3
2.20(s)
151
4a,5,5a
7‐
CH3
1.11(S)
230
6,7,8,7‐ CH20H
7‐
CH20H
372(d,113)
681
6,7,8,7‐ CH3
9
9a
377(d,113)
Fig. 56. Applanatine E (5).
‐100‐
l,4a,5a,8
2‐
2-6化 合 物 6の 構 造 解 析
化合物
6は 無色油状物質 として単離 された。ESIMSに お いて 〃z269[M+Na]+の 分子
イオンピー クが観測 された。IRに お いて 1715(C=0)、
クが観測 された。lH… NMR、
3410 cm‐
1(OH)に それぞれ
吸収 ピー
13c_NMRお よび
各種スペ ク トルデー タの比較 によ り、化合物
は化合物
5の 8位 のヒ ドロキ シ基をもたな い類縁体 であることが示唆 された
Table 7)。
構造解析 によ り、化合物
6を
3,4,7,8‐ tetrahydrocyclopenta[g]iSOChromen‐
(Fig。
6
58,59,
echinolactone D((D… 7… (hydrO獅 methyl)-5,7… dimethyl―
16o‐ one)と 同定 した (Fig.57,60)。 化合物
6は 天
あ ″″ノ
れた Imazeki)の 培養ろ液か ら
然物 として コウヤクマ ンネ ンハ リタケ じ働J″ ο
ψο
"“
““
18。
また、生物活性 として、レタス に対する植物成長促進活性が
単離 されたのが最初である
報告 されている
18。
COSY
一
HMBC
→
Fig.57.COSY and HMBC corre:ations in 6.
‐101‐
６ ′
／
３／
I
:
7(H。
︲
８ ＼７ ＼
Fig. 58. 1H NMR spectrum of 6 (in GDCIa).
￨
5・ CH。
4
7'clh
I
5{t{3
4a
5
／
8a
鮨
5a
Fig. 59. 13C NMR spectrum of 6 (in CDCI3).
・ 102‐
Table 7. 1H and 13c NMR data for 6 (in GDCIe).
lH
Ｃ δ
Position
δ(muLip‖ city,」 in Hz)
HMBC
lH t。
13c
ｌ
1663
３
438(dd,40,4.5)
４
287(dd,125,145)
ａ ａ
５
５
４
66.6
1,4,4a
248
1362
1308
4a,5,9a
148.6
６
2.54(d,145)
421
5,5a,7,8,8a,7‐ CH3,7‐ CH20H
444
424
5a,6,7,8a,9,7-CH3,7-CH20H
288(d,145)
7
259(d,135)
8
288(d,145)
8a
141.5
767(s)
9
9a
CH3
210(s)
CH3
7-CH20H
109(S)
5‐
7‐
3.44(s)
1240
1233
151
241
698
Fig. 60. Echinolactone D (6).
‐103‐
1,4a,5a,8,8a,9a
4a,5,5a
6,7,8
7,7-CH3
3節
第
抗 口腔 内細 菌 活 性 試 験
コフキサルノコシカケの培養 ろ液の酢酸 エチル可溶部か ら単離 した各化合物 について
F
″″ο
た勧″ に対す る抗細菌活性試験を行った。
F″ ″ο
ル勧物 を トリプチケー スソイ液体培地に移植 して 2日 間前培養を行 い、F″屁″
″″ の培養液に濃度調整 した
app脳incs
A―E(lⅢ 5)お よび cぬ価 lactone D
⑥ をそれぞれ
添加 して 3日 間本培養を行った。そ の結果、対照区の thymolと 比較 して、
印Ⅲm籠 ncs A(1),
B② ,D“ )に は強 い抗細菌活性が確認され、applanatine
または弱 いなが ら抗細菌活性が確認された
C c),CChholactone D(6)に
は同じ
cablC 8)。
Table 8.Antibiotic efFect oftho oach compound from C appranaram on the growth Of
几 ″υcreaom.
MICa
Compound
ppm
(μ
M)
1
2
3
4
3 13
3 13
100
3 13
(113)
(113)
(360)
(104)
Thymol
Positive control
ppm
(μ
100
M)
(667)
" Minimum inhibitory concentration.
b
Not tested.
‐104・
5
ntb
6
200
(813)
第
4節
考察
コ フキサル ノコ シカケ の培養 ろ液か ら単 離 された
applanatines A… C(1‐ 3)の 構造
―活性相
関 につ いて考察 した。F″
ルα勧 に対す る活性 にお いて、シク ロベ ンタ ンの部分構造 にヒ
“
ドロキ シメチルが 存在す る applanatines A(1),B(2)に は強 い抗細菌活性が確認 され、ベ ンゼ
"σ
ンの部分構造 にヒ ドロキ シメチルが存在す る a2pplanatine C(3)に は弱 い抗細菌活性が 確認
され た ことか ら、 この ヒ ドロキ シメチル の位置 が この抗細菌活性 に重 要 である ことが示 唆
され る
(Fig。 61)。
significant
position
〔
E
Fig.61.Structure口 activity re:ationship of applanatines toward月
Applanatines A― E(1‐ 5)お よび eChin01actone D(6)は
″ creary′ η
“
.
illudalane sesquiterpenOid類
に分類 さ
れる化合物群で ある。11ludalane sesquiterpenoid類 は天然物 として、 コウヤクマ ンネンハ リ
″Jε ツ Imazeki)に 由来する echinolactones18,19、 ィノモ トソウ 勧帝 ツ
タケ に ブ
ルメカ
ψο
“
“
『霞θ
コバ ノイ シカ グマ の θ″
″αscα b″ ニ シノコハ チジョウシダ lP.″
s"θ グ
力J"θ ″
sな
ワラ
“
ビ .α 9"J′ J″ ,Pた ガ″ bθ JJa)等 に 由来す る pterOsins20-27、 軟質サ ンゴ ばり ο肩 gra″ 赤
"“
"“
"“
『
И.′ αassル rめ に 由来す る alcyopterosins28,29等 、数多 くの化合物 が 単離 されている (Fig。 62)。
)、
)、
)、
,
また、生物活性 として、echin01actones A,B,Dは レタス に対す る植物成長促進活性 18,19、
pterosins B,N,0、
alcyopterosins A,C,E,Hは ヒ ト腫瘍細胞系 に対す る細胞毒性20,29,30等 が報
告 されて い る。しか し、illudalane sesquitapenoid類 に抗 回腔 内細菌活性 が示 されたの は最初
の報告 で ある。抗菌 薬 の長期 間 にわたる使用 は 困難 とされて いる 中で新 しい抗 口腔 内細菌
13■ 5、
活性物質 を発見 した ことは非常 に有効 で あ り
さ らに、 この様な薬理活性 の高 い化合物
群 にはさ らな る機能性 と医薬品 の発展 に対す る貢献 を期待 できる。
‐105‐
芦
て
ヾ
せ
ド
＼
み計
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)￨〕
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︵ ヘ
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D
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B
C
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三
´
人
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N
」
″
挙誇
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一
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♂t職・
M
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ご
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L
﹁
砕 Ｋ
一﹁
Ｆ
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Echinolactone A
H
く
治
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P
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嘉
Z
人
´
yK
ok。
く
ハこ
〕
メ
:〕
●
0´
´
」
♂膊 )(
ご
も
Fig. 62. Chemical structures of illudalane sesquiterpenoids.
Each compound has been isolated from natural source; echinolactones from the mushroom
(fungus); pterosins from the pteridophytes (plants); alcyopterosins from the soft corals (animals).
‐106‐
第
第
1節
3… 1‐
1機 器類
NIIR
3章
実験部
使用機器 および材料
JⅣ N― EX-270
FT NNIR Spectrometer(JEOLl
Lambda 500 FT NMR Spcctromctcr(JEOLl
MS
Accu TOF LC‐ plus JMS― T100LP Mass Spectrometer KJEOLl
IR
A,102 Dirracion Gratmg lntarcd Spectrometer cASCO)
Iα
D
】
HPLC
Digital polarmeter DIP-500(JASCO)
Colullln
Dc“ losil C30■ G-15/30 oKlmura chcnlica)
D、ま osil C30-UG-5い omura
Chelllical)
CAPCEIL PAK C18 AQ(SLsCidO)
P,岬
PU-2089 Plus Quatcrnary Gradcnt Pump lJASCO)
PU-2080 Plus htelligent IIPLC Pulmp(JASCO)
L-2130(HITACHD
Dctcctor
llV 2075 Plus htcnigent uv/VIS Detector(JASCO)
875-UV htelligent UV/VIS Detector KJASCO)
diodc Array Dctcctor L-2455(Hmヽ CHI)
Rccordcr
807-IT htcgrator(JASCO)
Automatic sampler
AS‐ 2055 Plus lntelligcnt Sampler(JASCO)
sonwac
Chromatography Data Station ChromNAV(JASCO)
ELITEoIIIrACHD
hterface
LC‐ NeI1/ADC(JASCO)
Silica gel
611N for colulml chromatograply(blltO Chemlcal Co,hc)
ODS gel
Cosmosil 140C18 OPN for colШ α
n chromatogaphy lnaCalaitesque)
TLC
DC‐ Alufoliell Keselge1 60 F254(MCrCk Ltd)
DC― Alufolien RP-18ら 54(MerCk Ltd)
‐107‐
3‐ 1‐
2材 料
森林総合研究所に保管 されているコフキサルノコシカケの種菌
ο
″初αω´
(Gα ″
α
″″)
“
を使用 した。抗 口腔内細菌活性試験 には、株式会社 ロッテ中央研究所 に保管 されている歯
た″″
″″cた 勧 ″ATCC25586)を 使用 した。
周病細菌 σttο bα ε
“
‐108
2節
第
コ フキサ ル ノ コ シカ ケ 由来 の 抗 口腔 内細 菌 活 性 物 質 の 単 離 ・ 精 製
コフキサル ノコシカケの種菌 をポテ トデキス トロース液体培地 (250 mL;04%ポ テ ト抽
20%デ キス トロース、Difco)を 注入 した三角 フラス コ (500mり に移植 し、温度 22℃ 、
出物、
回転数 130 rpmの 条件で
4週 間培養 を行 った。その後、ろ過によって菌糸体 と培養 ろ液に
ヘキサ ン (3回
分離 した。菌糸体は凍結乾燥後破砕 し、″―
回
)、
酸エチル可溶部 o073 mg)、 エ タノール可溶部
(288.8 mg)、
1238.O mgl、
エ タノール可溶部
エタノール
)、
酢酸エチル (5回
(263 7 mgl、
(3
(206 mD、 酢
水可溶部 (2H.9 mg)を 得た。
エタノール (3回
)、
(15Dか ら ″‐ヘキサ ン可溶部
で順次浸漬抽出を行 い、培養ろ液
溶部
)、
酢酸エテル (3回
(1019か ら″―ヘキサ ン可溶部
水 (3回 )で 順次浸漬抽出を行 い、菌糸体
ヘキサ ン (3回
培養ろ液は減圧濃縮後、″―
)、
)、
水 (1回 )
酢酸エチル可
(23.O mg)、
20 glを 得た。さらに、大量
水可溶部
培養を行 い、培養ろ液 (30 Llか ら酢酸 エチル可溶部 (15.5g)を
“ 得た。
培 養 ろ液 の 酢 酸 エ チ ル 可 溶 部
(15.59を シ リカ グ ル の フ ラ ッ シ ュ カ ラ ム ク ロ マ
ィ ー (snica gC1 60N,250g,35φ × 520
mm;CH2C12/EtOAc 90:10,7030,5050,EtOAc,EtOAc/
MeOH 7030,5050,MoOH)に よ り 13画 分 に 分 画 し た 。画 分 8(2.2g)は ODSゲ
ッ シ ュ カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー
MeOH/H205050,McOH)に
さ らに、 画 分
8‐
より
トグ ラ フ
(ODS gel Cosmosil 140C13 OPN,200g,35ψ
50%MeOH溶
出部 と
MoOH溶
出部 の
ルのフラ
× 220
mm;
2画 分 に 分 画 し 、
1(1 4 glは 逆 相 HPLC oeve10Sil C30 LIG-15/30,50ψ ×500 nlln;MeOH/H20
5050)に より 12画 分に分画 した。さらに、画分 8-1-8(50.7mDか ら逆相 HPLC(Develosil
C30-UG-5,20φ ×250 111nt;MeOH/H204060)に よって化合物 6(31.8 mg)を 単離 した。画分
9(3 7 glは シリカゲルのフラッシュカラムクロマ トグラフィー (siliCa ge1 60N,250g,35 ψX
520 111nl;CH2C12,CH2C12/aCetone 95:5,90:10,80:20,60:40,30:70,acetone,acetone/MeOH 50:50,
MeOH)に よ り 15画 分 に 分 画 し、さ らに 、画 分
ら逆 相 HPLC ocve10Si C30‐ UG‐ 5,20φ ×250
9-2(20.4 mgl,9‐
3(304 mD,9‐4(52.7 mg)か
11ml;MeOH/H206040)に よ っ て 化 合 物 1“ .0
mg,hm tacion 9‐ 2),2(90 mg,hm taction 9-3),3(23 mg,from haction 9-4),4(22 mg,from
■acion 9‐ 2 and 9‐ 3)を それぞれ 単離 した。 また、画 分
(CAPCELL PAK C18 AQ,20ψ
画分
9‐
54(8,O mg)か
5050)に
ら逆 相
よ って 化 合 物
×250
9‐
5(1262 mg)は 逆相 HPLC
mm;M● OH/H207030)に よ り 9画 分 に 分 画 し 、 さ ら に 、
HPLC(CAPCELL PAK C18 AQ,20φ
SoOmg)を
× 250
mm;McOH/H20
単 離 した。
Applanatte A(1).C。 10■ ess oit[倒 ♂ 5_26(ο 02,MoOHゝ R● eat,V硼 0:3460 cm l;lH alld BC
NⅣ R,sce Fig 6,7 and Table 2;ESIMS p/z301[MINa]ち
br C17H26Na03,301.1780)
ヽ109・
HRESMS潔 2301.1761 1MINal+(calCd
Applanatine B ② .Co10rless ot[可 ♂5_20
o O.9,MeoD;IR oet‰ :3457面 1;lH and BC
ω
NⅣ R,scc Fig 17,18 and Table 3;ESIMS″ /z301 NINal+;IIIRESIMS a/z3011763[MINal+
(CalCd fOr c17H26Na03,3011780)
Applanatine C o).C。 10rlcss dt[倒 D25_9.5● 02,MeOH);IR ocat,ミ 豪
NヽR,scc Flg 28,29 and Tablc 4;ESIMS″
:3421cが ヽ lH and 13c
/z301 MINal+;IIRESIMS″ノン3011780[MINal十
(CalCd fOr c17H26Na03,3011780)
Applanatine D“ ).Co10rless dL[倒 D25.45● 01,MCOH)IR Kncat,ヾ ぬ :1718oぼ 1;lH
alld 13c
NNIIR,see Flg.38,39 and Tablc 5;ESIMS a/z303 PI+H]+;HRESIMS″ 2 303 1619 PI+H]+
ealcd for c18H2304,303159o.
Applanai“ E③
.Co10rless o■ ;[α ]♂
3+24● 02,MeOH〉 IR Kncat,V[ω :1703,3400 crt lH
and 13c NMR,scc Fig 49,50 and Table 6;ESIMS a/z285[M+Nalt IIRESIMS a/z285.1098
[MINa+(calCd fOr C15H18Na04,285.H03)
Echinolactone D(o.Co10rlcss oit[α
]♂
9+10(ο O,5 McOHゝ
IR oeat,VmO:1715,3410 cm l:lH
and i3c N卜 R,see ng 58,59 and Table 7;ESIMS″ ル 269[MINal+
-110‐
第
3節
抗 口腔 内細 菌 活 性 試 験
ブレイ ンハー トインフュー ジョン寒天培地 (100 mL;06%ウ シ脳 。心臓抽出物、0.4%動
物組織・ベ プシン消化物、1.1%カ ゼイン・膵臓液消化物、04%塩 化ナ トリウム、02%デ
キス トロース、02%リ ン酸水素ニナ トリウム、1.0%寒 天、BBLlで 保存 された F″″ο
ル魏
“
ATCC25586株 を トリプチケースソイ液体培地 (100 mL;30%大 豆ペプ トン、BBL10 3%酵
l N NaOH、 Acros otanicS 0 1%メ ナジオンー
母抽出物、BD;01%ヘ ミン‐
50%EtOH、 Sigmal
を注入 した三角 フラスコ (500 mLlに 移植 し、37° Cの 条件で 2日 間前培養を行った。その
の培養液を 10希 釈 し、96穴 プレー トに 100 μLの 希釈培養液を加えた。
“
対照区は 100 μLの 2%DMSOで 濃度調整を した t“mOlを 加え、試験区は 100 μLの 2%
ル磁
後、F″″ο
DMSOで 濃度調整 した各種サ ンプルを加えた。37° Cの 条件で
の後 、 目視 により最小阻害濃度 (MIC)を 確認 した。
3日 間本培養を行った。そ
論文要 旨
近年、キノコか ら植物成長調節活性、抗腫瘍活性、抗菌活性な ど多様な生物活性物 質が
発見 され、農業分野および医薬品分野で の応用が期待 されている。本論文ではフミヅキタ
および コフキサル ノコシカケ
物α ノ
)に 由来する生
"α "″
“
に関 して以下 の 2つ の項 目につ いて研究 した。
物活性物質
“
ケ
graり う
ο′″の
雄
(Gα ″
1)フ ミヅキタケ む o″レ ′″ec→ に由来す る植物成長調節物質 の探索
新潟県 のある ビニールハ ウスで、通常よ りも肥大 したイチ ゴの実が現れ、そ の後 、根元
の土壌か らフミヅキタケ
gr"″ θ′″′
ωめ が発生するとい う現象が確認された。一方 、フ
ミヅキタケ属 の菌がイチゴのす
くみ症状を引き起 こす病原菌 としても報告 されている。 こ
“
れ らの対照的な現象は、 この菌が植物 に対 して成長 を調節す る物質 を産 生 していることを
示唆 している。本研究では、 フミヅキタケに由来す る植物成長調節物質 の単離 。精製およ
び構造解析 を 目的 とした。
上記のビニールハウスか ら分離 したフミヅキタケを種菌 とし、ポテ トデキス トロース液
体培地 に移植 して
3週 間培養 を行 った。その後、遠心分離、ろ過によって菌糸体 と培養ろ
液 に分離 した。培養 ろ液を減圧濃縮後、酢酸エチルで分配抽出を行 い、生物活性試験の結
果 を指標 にしなが ら各種 ク ロマ トグラフィー による分画 を行った結果、化合物
構造解析 の結果、化合物
1‐
5を それぞれ
。
Cta_6‐ m‐ 2,4‐ dフ 咀
amide(3)、
Cリ ー
。Cta
6の ―
7を 得た。
octa_2,4dynamide(1)、 0-。 Ct 4-en-2-yn amlde(2)、
6-en-2,牛 dynalnidc(4)、 8-amhO-8-oxooCta 4,6-diynyl
acetate(5)と 決定 し、agrocybynes A― Eと 命名 した。また、
化合物
bcnzyl acctateと 決定 し、化合物
1‐
6を
2-fonnyl-3,5-dhydroxy
7を ο―
orsdlhddchydc(2,4‐ dlhydroxy‐ 6‐ methylbcnzaldehyde)
‐
と同定 した。
単離 した各化合物 について、 レタス
(キ
ク科
)、
イネ
(イ
ネ科)お よびイチゴ (バ ラ科)に
対する植物成長調節活性試験を行った。レタスに対 しては、化合物
化合物
1,5‐
7は
10 nlllol以
3,4は l nmol以 上で胚軸 または根 の伸長阻害活性 を示 し、化合物 2は
10 nlllol
以上で胚軸 の伸長阻害活性および根の伸長促進活性 を示 した。また、化合物 1,2は
で胚軸の伸長促進活性 の傾向 も観察 された。イネに対 しては、化合物
合物
3は 100 nMで 根 の伸長阻害活性 を示 した。また、化合物 1は
長促進活性、化合物
l nnlol
1は lnM以 上、化
l
μMで 地上部 の伸
2は 100 nmol以 上で地上部 または根 の伸長促進活性 の傾向 も観察 さ
れた。イチゴに対 しては、化合物
た。また、化合物
上、
1‐
5は
l nlno1/soil・
2は 根 の伸長 も観察 された。化合物
‐112‐
mLで 全て に植物体 の枯死が観察され
1‐
5は 顕著な活性 を示 した ことか ら、
フミヅキタケがイチ ゴの実 の成長 に対 して影響 を与えた主な原 因物質 として活性を示 した
可能性が示唆 される。現在、化合物
1‐
5の 合成 を行 い、化合物
1‐
5の イチ ゴの実 に対する
植物成長調節活性試験 を試みて いる。
0
〆+NH2
ノ〃
/へ▽ノ〃
ｌ
威
2
０
６
″
ヤｏ
Ｈ
H已
６
7
″
由来する抗 口腔内細菌活性物質 の探索
“ ")に
う蝕や歯周病 といった慢性変性歯科疾患 の原因である口腔内細菌によって引き起 こされ
2)コ フキサルノコシカケ (Ca"ル 翻 α″p″
る疾病 は広範囲にわたって人々に存在す るため、公衆衛 生上にお いて重要な問題である。
慢性変性歯科疾患 に関与す る様 々な病原菌に対 して抗細菌活性作用 のス クリーニ ングのと
α″ノa″ α繊″)に 由来する抽出物に歯周病 の主要な
“
′
″″″″
0ル 滅″ に対する抗細菌活性が確認された。本研究では、 コ
病原菌である E"ο ttcた′
ころ、コフキサル ノコシカケ
磁
(Gα ″
フキサルノコシカケに由来する抗 口腔内細菌活性物質 の単離・ 精製および構造解析 を 目的
とした。
コ フキサル ノコシカケの種菌 をポテ トデキス トロース液体培地に移植 して
4週 間培養
を行った。その後 、ろ過によって菌糸体 と培養 ろ液に分離 した。培養 ろ液を減圧濃縮後 、
酢酸 エチルで浸漬抽出 を行 い、生物活性試験 の結果 を指標 にしなが ら各種 ク ロマ トグラフ
ィー による分画 を行った結果、化合物 1-6を 得た。
構造解析 の結果、化合物
1‐
5を それぞれ
((1,,2辞
mttyl‐ 2,3‐ dthydro‐ lμ inden-2-yl)mCthanol(1)、
饉 me■ yl‐ 2,3‐ dlhydro‐ lμhden-2-yl)mC■ an。 1(2)、
2,3-dhttЮ -lμ mden-6-yl)mCmanOl 13)、
)‐
1‐
lllethoxン 5‐ (2‐ methoxye■
(1‐
me■Oxン 5-(2-mcthoxycthyl)‐ 2,2,4‐ 籠 mcthyl‐
(6aSⅢ ,10aSⅢ )-5,6a,9,9-tctramethyl‐ 3,4,6a,7,9,10a■
6を
exahy
(7S*,8SⅢ )‐ 8-hydroxン 7-oydrOXyhe
thyl)-5,7-dmcthyl-3,4,7,8‐ tcmhydrOcyclopentattiSOChrOmcn‐ 1(6o‐ one(5)と
ncs
饉
((lR・ ,2S■ )-1-methoxy‐ 5‐ 2‐ methOXyethyl)‐ 2,4,6‐
drocyclopenta[切 [8,10]diOXOnolgliSOChromen‐ 1(α つ ―One(4)、
｀
A― Eと 命名 した。また、化合物
yl)‐ 2,4,6‐
決定 し、applanatl―
echholactone D(o‐ 7‐ oydrOttmethyl)-5,7-dlmethyl―
34,7,8‐ tctrahydrocyclopenta[g]iSOChromen-1(6o―
onoと 同定 した。
単離 した各化合物 について、F′ ″cル 磁
に対す る抗細菌活性試験 を行 った。その結果、
“
対照区の thwolと 比較 して oosiiVe control,MIC,100 ppm,667 μM)、 化合物 1,2,4は 強 い
‐113‐
lり 、化合物
抗細菌活性が確認され (l and 2,MIC,3.13 ppm,H.3μ M;4,MIC,3 13 ppm,10.4 μ
3,6は 同 じまたは弱いながら抗細菌活性が確認 された o,MIC,100 ppm,360 NV1 6,MIC,
200 ppm,813μ り 。
0´
H
OH
″
11)〔 」
〕
ヽ｀
D´
蹄
'′
3
0
脚
岬
6
‐114‐
Summary
Chaptrr
1,
Agrocybynes A-E from the culture broth of Agroqbe praecox,
Lr 2007, abnormal enlargement of shawberry fruits was observed and a kind of mushroom
grew near the stimulated fruits in a greenhouse in Niigata prefectue, Japan. It was identified
as
Agrocybe praecox (English name, Spring Fieldcap; Japanese name, Fumizukitake). On the other
hand,
it
has been reported that an Agrocybe sp. caused cringing
of stawberry fruits. These widely
varying phenomena related to gror+dr stimulation and suppression, suggest that Agrocybe gems
produces plant growth regulato(s). Our purpose is to find the plaat growth regulators from the
fungus, and is chemical studies on effect of the metabolites fiom the mushroom on plants.
The fungus was cultivated and then it was divided into the mycelia and the culture broth. Each
part was successively extacted. The culture broth of ,4. praecox, was concentated under reduced
pressure, and was partitioned between EiOAc aad water. The EtOAc-soluble part was fractionated
by each columl
chromatogra.phy, being guided
by the result of the
bioassay, leading
to
the
purification of compounds 1-7.
The struchues of those compounds were determined by spectroscopic analyses. As a result,
compounds 1-5 were detennined as octa-2,4-diynamide (1), (@-ocf4-en-2-ynamide (2), (Q-octa-6en-2,4-diynamide (3), (E)-octa-6-en-2,4-diynamide (4), 8-amino-8-oxoocta4,6-diynyl acetate (5)
and were named agrocybynes A-E, respectively. Furthermore, compound 6 was detennined as 2-for
myl-3,5-dihydroxytenzyl acetate and compound 7 was identified as o-orsellinaldehyde (2,4-dihydro
xy-6- methylbenzaldehyde).
The effects of the compounds on plant growth were tested toward lettuce (Asteraceae),
ice
(Poaceae) and strawberry (Ros aseae). As a result, compounds 1, 3-7 inhibiied the hypocotyl and the
root grolrth at
1
nmol to
I
pmol, and compound 2 inhibited the hypocotyl and the stimulated tlle root
growth at more 10 nmol toward lettuce. Compounds 1 and 3 inhibited the root growth at 1 pM and
100 nM toward rice, respectively. Compounds 1-5 were dwarfed and altered in coior at
I nmol/soil-
mL toward shawberry. We are now trying to synthesize these compounds and plaaning cultivating
experiments of skawberry fruits using them.
2
OHO
0ざ
H本
G
Hパ
7
‐115‐
Chapter
2.
Applanatines A-E from the cultrre broth of Ganodenra apphnafrtm.
Chronic-degenerative dental diseases, including periodontal diseases, are widespread in
human populations and rq)resent a significant problem for public health. Fusobacteium nucleatum
is a Gram-negative obligate anaerobe and a prominent member of the oral microflora implicated in
periodontitis, a disease affecting 5-15% of most populations worldwide. During screening for the
antibiotic activity of extracts of various mushmoms against F. nucleafion grotth, we found strong
inhibitory activity in the exhact of the culture broth of a fingts Ganoderma applanatum (Japanese
name, Kofukisarunokoshikake), and aied to isolate the active molecules from the culture broth.
The fungus was
culti
ted and then it was divided into the mycelia and the culture broth. Each
part was successively exbacted. The culture broth of G. applanatum, was concenhated under
reduced pressure, and was extracted with EtOAc. The EtOAc-soluble part was fractionated by each
column chromatography, being guided by the result of the bioassay, leading to the purification
compounds
of
1{.
The shuctures of those compounds were determined by spechoscopic analyses. As a result,
compounds 1-5 were determined as ((1S*,2S*)-1-methoxy-5-(2-methoxyethyl)-2,4,6-aimethyl-2,3dihydro.1l1-inden-2-yl)methanol
(1), (1X*,2^S*)-1-methoxy-5-(2-methoxyethyl)-2,4,6-tnmethyl-2,3
-dihydro-1I1-inden-2-y1)methanol (2), (1-methoxy-5-(2-methoxyethyl) -2,2,4-finethyt-2,3-dihydro-
IIl-inden-6-yl)methanol (3), (6a.9*,l0a.t'i)-5,6a,9,9-tetamethyl-3,4,6a,7,9,10a-hexahydrocyclopenta
[d][8,10]dioxonoplisochromen-1(611)-one
(4), (7S*,8.f*)-8-hydroxy-7-(hydroxyLnethyl)-5,7-dime
thyl-3,4,7,8-tetrahydrocyclopentatglisochromen-1(6I1)-one
(5) and were named applanatines A-8,
respectively. Futhermore, compound 6 was identified as echinolactone
5,7 -dimethyl-3,4,7,8-tetrahydrocyclopenta[g] isochromen-
1
D (.9)-7-(hydroxymethyl)-
(611)-one).
The antibiotic effects of the compounds on the growth of F. nucleatwn were tsted in
vitro.ln
this experiment, thymol was used as the positive control and its MIC was 100 ppm (667 mM). Compounds 1 (MIC, 3.13 ppm, 11.3 mM), 2
(MIC,3.l3 ppm,
11.3 mM), and 4 (MIC, 3.13 ppm, 10.4
mM) were stronger inhibitors than the control, though 3 and 6 inhibited at higher concenhations, 100
ppm (360 pM) and 200 ppm (813 pM), respectively.
0´
、
叶
H
縦
‐116‐
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sOだだo.
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ο
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Plant‐
4‐
carbox面 dc produced by f嵐 ry‐ 五ng fonning nmgus
"ut rcgulator9 midazole‐
ι お″ sο だ通α
.
52
`′
Bohhann,F
ο″αl,CLι ″ Bθ 4 1956,89,2268‐ 2272
Polyacetylcnc compounds.XVIII.Thc light absorpion ofpoly7nccttboxylic acid H■
53
les
Prcvost,S θ′αi,θ ″″ ミ∝ Cみj“ F/ 1961,2171‐ 2175
Prepaadon ofnamrally occurnng C10 and C13 poly,cctylcncs and ofrclatcd compoullds
54 Ballanin9,JAα クlP″わC力 ι お″ 1968,ろ
Biosynhesis of phenols XVⅡ
1529‐ 1534
“
Some phenolic mctabolitcs of mutatlt stralns ofス ッο電
==麻
″多 加
".
55 Hi、 t,L.E.JCみ σ″
D“ vatlves
S● ο 1927,2490-2495.
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J● Sα
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謝辞
本研究 の指導教官である静岡大学創造科学技術大学院自然科学系教育部バイオサイ エ ン
ス専攻 教授 河岸洋和 先生 には、その遂行 にあた り終始御指導 くださいましたことをここ
に深謝 の意を表 します。 同大学院 教授 衛藤英男 先生、教授 渡辺修治 先生、静 岡大学農
学部応用生物化学科 准教授 平井浩文 先生 には、副査 として御助言 を頂 くとともに本論文
の細部にわた り御指導 くださいました ことをここに深謝 の意を表 します。
本研究の第 1部 において、新潟県森林研究所 松本則行 氏 には、フミヅキタケの菌糸体
の単離 。同定な らびに試料 を提供 して くださいました ことをここに深謝 の意を表 します。
森林総合研究所 関谷敦 氏、静岡大学農学部応用生物化学科 准教授 徳山真治 先生、安西
航太 氏 には、フミヅキタケの培養を行 うにあた り御指導な らびに御助言 くださいましたこ
とをここに深謝 の意 を表 します。静岡大学農学部共生バイオサイエンス学科 准教授 切岩
祥和 先生、桂武彦 先生、小松芳則 氏 には、イチゴの栽培を行 うにあた り御指導な らびに
御助言 くださいました ことをここに深謝 の意を表 します。静岡県立大学薬学部分子薬学大
講座 教授 菅敏幸 先生、准教授 濱島義隆 先生、助教 浅川倫宏 先生、助教 稲井誠 先生、
永尾大祐 氏 には、agrocヵ yne類 の合成 を行 うにあた り御指導な らびに御助言 くださいまし
た ことをここに深謝の意 を表 します。理化学研究所 橋爪大輔 博士には、agrocybync類 の
構造決定 を行 うにあた り
X線 結晶構造解析を行って くださいました ことをここに深謝 の
意を表 します。東京農工大学工学部生命工学科 教授 長澤和夫 先生には、本研究の学術論
文を投稿するにあた り御指導 な らびに御助言 くださいました ことをここに深謝 の意 を表 し
ます。
本研究 の第
2部 において、森林総合研究所 関谷敦 氏 には、コフキサルノコシカケの培
養 を行 うにあた り御指導な らびに御助言 くださいました ことをここに深謝 の意 を表 します。
静岡大学農学部応用生物化学科 堀川まどか 氏、鈴木香里 氏 には、コフキサル ノコシカケ
に由来する天然物 の単離・ 精製および構造決定を行 うにあた り実験 の援助な らびに資料 を
提供 してくださいました ことをここに深謝 の意を表 します。株式会社 ロッテ中央研究所 菅
野範 博士、志村進 博 士には、抗 口腔内細菌活性試験 を行 うにあた り試験の実施な らびに
資料 を提供 してくださいましたことをここに深謝 の意 を表 します。
元静岡大学農学部応用生物化学科 教授 現副学長 確氷泰市 先生、静岡大学農学部応用
生物化学科 准教授 村 田健臣 先生、特任助教 尾形慎 先生をは じめとす る諸先生方には、
修士課程時代か ら御指導な らびに御助言 くださいましたことをここに深謝 の意 を表 します。
‐125・
静岡大学農学部応用生物化学科 の本研究室 である生物化学研究室 に所属す る鈴木智大 博
士、在宰薫 博士、Aditya Kulk田■ 博士、服部武史 氏および研究室に所属 していた上 田恵
子 博士、杉浦立樹 博士をは じめとする諸先輩方な らびに研究室 の方 々、静岡県 立大学薬
学部分子薬学大講座の医薬品製造化学講座 に所属す る研究室の方 々 には、この
5年 間大変
御世話 にな りましたことをここに深謝の意を表 します。
元東海大学農学部応用動物科学科 教授 信國喜八郎 先生、東海大学農学部応用動物科学
科 教授 芝田猛 先生をは じめとす る諸先生方 には、学部生時代 に御指導な らびに御助言 く
ださり、また大学院に進学す るにあた り大変御世話 にな りましたことをここに深謝 の意を
表 します。
最後 に、今 日まで学問を追及す ることを許 し、それに対 して金銭面 のみな らず精神面 に
おいても支えて くださいました家族、そ して親戚、友人、知人の方 々 には、尽 くしきれな
い感謝の意 を表 します。本当にありが とうございました。
‐126・