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Ⅲ．血清学的診断の方法 １．抗血清の作り方
動物はウイルスや細菌に感染すると、その病原体の表面に存在するタンパク質や多糖
類（抗原）を認識して、その病原体に特異的に結合する抗体を産生して自らを守ろうと
する免疫系を作動させる。この動物の免疫系を利用して、植物病原体に特異的に反応す
る抗体を得ることができる。
具体的には、精製し
た植物ウイルスや、培
養した細菌を抗原とし
て、ウサギなどの実験
動物に筋肉、皮下ある
いは静脈に注射（投与）
して一定期間経過後に
血液を採取し血清を得
る。この血清中には、
注射した抗原（植物ウ
抗体は免疫グロブリンと呼ばれる Y
字状のタンパク質で、H 鎖（重鎖）
と L 鎖（軽鎖）計 4 個のポリペプチ
ドからなる。H 鎖の先端は可変部と
呼ばれ、決まった抗原の特定部位と
結合する。この反応を抗原抗体反応
と呼ぶ。抗体は血清中に含まれ、免
疫グロブリン G（IgG）が多数を占め
る。
イルスなど）に特異的
に反応する抗体が含ま
れていて抗血清と呼ばれる。
２．抗血清の利用
この抗血清を利用して、植物の病原体を検出・診断する方法を血清学（免疫学）的診
断法という。植物病原体の中では、ウイルスや細菌の検出・診断に主に用いられている
が、糸状菌では疫病菌の診断に実用的に利用されている。
血清学的診断法は、抗血清（抗体）を準備しておけば、大掛りな設備のない実験室に
おいても、簡便、迅速、比較的安価に植物のウイルス病や細菌病などの診断ができると
いう特徴がある。
植物病の血清診断法は多種多様であるが、大まかに分類すると、抗原抗体反応を、
① 直接的に肉眼で観察する方法
スライド凝集反応、ゲル内拡散法、リングテスト
② 顕微鏡や電子顕微鏡で拡大して観察する方法
蛍光抗体法、免疫電子顕微鏡観察法
③ ラテックス、酵素、放射性物質などを利用し反応を増幅して観察する方法
ラテックス凝集反応、ELISA
などに分類することができる。普通③の方法が最も高感度である。
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◆スライド凝集反応◆
スライドガラス上で抗原‐抗体の凝集反応の有無を観察する方法で、最も単純で簡易
な方法である。ただ、貴重な抗血清を多量に消費するため、現在ではほとんど使用され
ないが、抗原抗体反応を直接、肉眼で見ることが出来る。
材料：Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Pseudomonas syringae
抗 Xanthomonas oryzae ウサギ生血清
方法：①スライドガラスに生理食塩水（0.85 % NaCl 水溶液）を 50 µl 乗せ、白金
耳でかきとった菌体を懸濁する。
②2 倍希釈した血清を一滴（50 µl）スライドガラスに乗せ、菌液と混合する。
③凝集反応を確認する。
図 12 凝集反応 ※抗原・抗体いずれかが過剰な場合、凝集反応が起こりにくいことがある。
※1, 2 分以内に現れるものが陽性で、3 分以上過ぎて起こる凝集は目的とする抗原
抗体反応によるものではないことがあるので注意する。
図 13 左：陽性 右：陰性 2
◆ゲル内拡散法◆
ゲル平板の穴に抗血清と抗原を入れ、それらが拡散してゲル内で反応したときに生じ
る沈降帯を観察する方法。二重拡散法を用いると、形成される沈降帯パターンにより、
血清学的に同種か近縁であるかが推定できる。
図 14 ゲ ル内
拡散
例 A=抗原 S=抗 A 抗体 ａ=A と同等の抗原 W=MQ 水
材料：TMV（Tabaco mosaic virus）感染タバコ（Nicotiana tabacum cv. White Burley）
健全タバコ（Nicotiana tabacum cv. White Burley）
抗 TMV ウサギ生血清
方法：①0.1 M Tris-HCl 緩衝液（pH 8.0）120 ml に、ゲランガム 0.36 g（0.3 %）と
塩化マグネシウム六水和物（MgCl2・6H2O）0.24 g（0.2 %）を加え、電子レ
ンジで溶解する。
②溶解したゲル 10ml を熱いうちに駒込ピペットで
5 cm シャーレに流し広げる。
③固まったら図 16 の上にシャーレをのせ、図に従っ
てコルクボーラー（No.3）で７か所打ち抜き、打
ち抜いたゲルを柄付針で取り除き穴を空ける。
④TMV 感染タバコ葉、健全タバコ葉を磨砕してサン
プル液を調整する。約 5
図 15 穴 の空 け方 10cm 程度の葉を磨砕袋に入れ、リン酸バッファー
1ml を加える。乳棒でよく磨砕する。
サンプル液は 2ml ずつ作製する。
⑤磨砕液をピペットで 1.5ml チュー
ブに回収し、15000rpm、室温（20℃）
で 5 分遠心分離する。この上清をサ
ンプル液として使用する。
⑥図 16 を参考に、サンプルを 100
μl ずつ滴下する。血清(4 倍希釈)を
中央の穴に 100μl 滴下する。
図 16 3
⑥シャーレは湿らせた紙をしいたタッパーに入れ、室温で静置する（調査作業室の 25℃
インキュベーターに入れておく）。4 日後（月曜日）に反応を観察する。
◆ELISA◆（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, 酵素結合抗体法）
ダブルサンドイッチ法 double antibody sandwich method: DAS-ELISA
マイクロプレートにウイルスを抗原とする抗体を吸着させ（コーティング）、試料汁
液を添加する。もしウイルスが存在すればウイルスは抗体に捕捉される。これにコンジ
ュゲート抗体を添加し、捕捉されたウイルスに結合させ、基質を添加すると酵素によっ
て基質が分解され、溶液の色が変化することでウイルスを検出することができる。
図 17 ELISA 法の原理 ★コンジュゲート（酵素標識された抗体）
抗体に酵素（アルカリフォスファターゼ）を結合させたもの。アルカリフォスファ
ターゼは基質溶液（p-ニトロフェニルフォスフェート：無色透明）を分解し黄色に変
化させる、これを波長 405 nm の吸光度で測定し分解された基質の量を計る。分解量
は、試料中に含まれる抗原（ウイルス）の量に比例する。
材料：蘭（カトレア、シンビジュウム、オンシジュウム、デンファレ、デンドロビ
ウム、コチョウラン）
抗 ORSV（Odontoglossum ringspot virus）DAS-ELISA キット
（コーティング用抗体、コンジュゲート抗体）
抗 CymMV（Cymbidium mosaic virus）DAS-ELISA キット
（コーティング用抗体、コンジュゲート抗体）
試薬：●10
PBS（0.02M リン酸緩衝液生理食塩水 pH 7.4） 300ml/班
塩化カリウム（KCl）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 0.6g
リン酸二水素カリウム（KH2PO4）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 0.6g
リン酸水素二ナトリウム（Na2HPO4・12H2O）̶̶̶ 8.7g
4
塩化ナトリウム（NaCl）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 24g
蒸留水 300ml に溶解する。300ml メディウム瓶に入れる。
●PBS-T（PBS＋0.05% Tween 20）
10
PBS̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 100ml
Tween 20̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 500μl
蒸留水̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 900ml
足りなくなったら随時作製し、専用の洗瓶に補充する。
●磨砕用緩衝液 PBST-PVP（PBS-T＋2% PVP） 100ml/班
10
PBS̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 10ml
Tween 20̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 50μl
蒸留水̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 90ml
PVP（polyvinilpyrrolidone）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 2g
よく撹拌して PVP を溶解する（発泡注意）。100ml ボトルに入れる。
●コーティング用緩衝液（0.05M 炭酸緩衝液 pH 9.6） 30ml/班
炭酸ナトリウム（Na2CO3）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 0.048g
炭酸水素ナトリウム（NaHCO3）̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶̶ 0.087g
蒸留水 30ml に溶解し、pH を確認する。50ml チューブに入れる。
●10%ジエタノールアミン水溶液 30ml/班
①ジエタノールアミン 3ml を蒸留水 20ml に溶解する。
②HCl で pH 9.8 に調整する。
③調整後、蒸留水で 30ml にメスアップする。
④塩化マグネシウム六水和物 3mg を加える。
50ml チューブに入れる。
●3N NaOH 水溶液 10ml/班
NaOH 1.2g を蒸留水 10ml に溶解する。15ml チューブに入れる。
方法：
１．コーティング（第 1 日目）
① コーティング液（抗体）を 0.05 M 炭酸緩衝液（pH 9.6）で 500 倍に希釈(6ml
＋12μl)し、マイクロプレートの各ウエルに 200 µl ずつ分注する。（ORSV、
CymMV をそれぞれ一枚のプレートに半分ずつ分注する。外周一列を除き、各
5
24 ウエルずつにコーティングする。液が混入しない様に注意すること）
② マイクロプレートを、濡らした紙を敷いたタッパーに入れて湿室に保ち、4℃で
一晩静置する。
第 1 日目ここまで・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ③ マイクロプレートを PBS-T（PBS＋0.05 % Tween 20）で洗浄する。バットに
プレート内のコーティング液を捨て、キムタオルで水分を切ってから PBS-T を
それぞれのウエルいっぱいに注ぐ。1~2 分置いてから液をバットに捨て、キム
タオルで水分を切る。PBS−T での洗浄は計 3 回おこない、最後に水分をよく切
る。ラップに包んで-80℃で保存する。（金曜日に代表者が洗浄する）
図 18 ELISA サ ンプ ル 分 注図 ２． 試料処理（試料をウエルに入れる）（第 2 日目）
① 試料（約 1 cm
2 cm）を 20 倍量（約 3 ml）の PBST-PVP（PBS-T＋2 % PVP）
中で摩砕し、上清を検定試料として各ウエルに 200 µl ずつ分注する。（分注の
位置は図 18 参照。1 サンプルに 4 穴、コントロールは 2 穴使用する。何番のラ
ンサンプルをどのウエルに入れたか、必ずメモしておくこと）
② マイクロプレートを、濡らした紙を敷いたタッパーに入れて湿室に保ち、4 ℃
で一晩静置する。
第 2 日目ここまで・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ③ マイクロプレートを PBS-T で洗浄する。バットにプレート内のサンプル液を捨
て、キムタオルで水分を切ってから PBS-T をそれぞれのウエルいっぱいに注ぐ。
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1~2 分置いてから液をバットに捨て、キムタオルで水分を切る。PBS−T での洗
浄は計 4 回おこない、最後に Milli Q で 1 回洗浄する。水分をよく切ってラッ
プにつつみ、‐80℃で保存する。（湿室中 4℃で保存も可）(金曜日に代表者が
洗浄する)
３． コンジュゲート処理（第 3 日目）
第 3 日目実習前に事前作業・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ① コンジュゲート液（抗体）を PBS-T で 500 倍に希釈 (6ml＋12μl) し、マイク
ロプレートの各ウエルに 200 µl ずつ分注する。
② マイクロプレートを、濡らした紙を敷いたタッパーに入れて湿室に保ち、37 ℃
で 2 時間静置する。
第 3 日目実習・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ③ マイクロプレートを PBS-T で洗浄する。バットにプレート内のサンプル液を捨
て、キムタオルで水分を切ってから PBS-T をそれぞれのウエルいっぱいに注ぐ。
1~2 分置いてから液をバットに捨て、キムタオルで水分を切る。PBS−T での洗
浄は計 5 回おこない、最後に水分をよく切る。
４． 基質溶液添加
① 10 %ジエタノールアミン溶液に p-ニトロフェニルフォスフェート（基質、4℃
保存）を 1 mg/ml (約 12ml に 12mg 溶かす) 溶解し、基質溶液とする。
② 基質溶液を 200 µl ずつ各ウエルに分注する。
③ 基質溶液の添加から 15∼30 分後に 3 M NaOH 水溶液を各ウエルに 50 µl ずつ
分注し、反応停止を行う。
④ プレートリーダーで 405 nm の吸光度を測定し、試料のウイルス感染の有無を
判定する。感染の有無は肉眼でも判断することが可能である。
注意点
１．コーティング溶液、コンジュゲート溶液は必ず同じウイルス用を用いること。
すなわち、ORSV 抗体でコーティングしたウエルには、必ず ORSV コンジュ
ゲートを使用すること。誤って、ORSV 抗体を処理したウエルに、CymMV 用
コンジュゲートを用いると結果は得られない。
２．マイクロプレートの洗浄は丁寧に行うこと。
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◆イムノクロマト法◆
CMV Immuno Strip（金コロイド免疫クロマト法、Agdia 製）
図 19 イ ムノ クロ マト 原 理 材料： CMV 感染タバコ（Nicotiana benthamiana）
健全タバコ（Nicotiana benthamiana）
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方法：①抽出袋の上部をハサミで切り、袋をあける。磨砕液がこぼれない様に注意する。
②サンプル（約 2 cm
2 cm）を抽出用袋に入れ、上からペンの先などで葉をす
りつぶす。
③テストストリップを抽出用袋の透明な部分に挿しこみ、そのまま 15 分程静置
する。ストリップを挿しこみすぎると検出がうまくいかないので、かならずスト
リップの先端部分だけを抽出液に触れさせておく。
◆電子顕微鏡における免疫染色（免疫電顕）◆
ウイルスなどの特定の抗原を、その特異抗体によってコーティングし、電子線の透過
を妨げることで可視化させる方法。組織中の抗原（ウイルス）局在や、観察された抗原
が目的の抗原であることを確認するために用いられる。
ウイルス粒子に抗体がついた場合、ウイルス粒子の周りに暗い影ができる(図 19)。
たとえば、形態では区別できない 2 種のウイルスが重複感染している試料の場合、一方
のウイルスに対する抗血清を処理すれば 1 種類の粒子だけが修飾を受け、抗体が結合し
ていないもう一方のウイルスと明確に区別ができるようになる。 材料：Potato virus Y（PVY）
Helleborus net necrosis virus（HeNNV）
抗 HeNNV 抗体
方法：パラフィルムに液滴をのせ、作業をおこなう。
先に抗体とウイルスのどちらをグリッドに吸着させ
るかで、二種類の手法に分けられる。
図 19 抗 体結 合し た PPV 粒 子 ●デコレーショントラップ法（今回使用した手法）
グリッドにあらかじめウイルスを吸着させ、その周りに抗体を結合させる方法。
①試料となるウイルス感染植物片を、生理食塩水中でカミソリを用いて刻む。この
抽出液にグリッドを浸けて、15 分吸着させる。余分な水分は濾紙で吸い取る。
②MQ 水の水滴にグリッドを浸けて、濾紙で余分な水分を吸い取る。この洗浄を 9
回繰り返す。
③抗ウイルス抗体液にグリッドを浸けて、15 分吸着させる。余分な水分は濾紙で
吸い取る。
④MQ 水の水滴にグリッドを浸けて、濾紙で余分な水分を吸い取る。この洗浄を 5
回繰り返す。
⑤洗浄後、PTA 1%液にグリッドを浸ける。すぐに濾紙で液を吸い取り、乾燥。
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●トラップ法
まずグリッドに抗体を吸着させ、そこに抗原となるウイルスをトラップする方法。
①抗ウイルス抗体液にグリッドを浸けて、15 分吸着させる。余分な水分は濾紙で
吸い取る。
②MQ 水の水滴にグリッドを浸けて、濾紙で余分な水分を吸い取る。この洗浄を 5
回繰り返す。
③試料となるウイルス感染植物片を、生理食塩水中でカミソリを用いて刻む。この
抽出液にグリッドを浸けて、15 分吸着させる。余分な水分は濾紙で吸い取る。
④MQ 水の水滴にグリッドを浸けて、濾紙で余分な水分を吸い取る。この洗浄を 9
回繰り返す。
⑤洗浄後、PTA 1%液にグリッドを浸ける。すぐに濾紙で液を吸い取り、乾燥。
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