1. No category

バイオプロピレン生産を目指した
プロパノール発酵技術の開発
大阪府立大学
大学院 生命環境科学研究科
応用生命科学専攻
教授
片岡 道彦
1
背景
化石資源依存型社会から資源循環型社会へ
バイオプロセス
糖
バイオマス
エタノール
ブタノール
バイオ燃料
CO2
燃焼
エネルギー使用
エタノール等のバイオ燃料
⇒ 燃焼により、すぐにCO2が排出される
2
背景
化石資源依存型社会から資源循環型社会へ
バイオプロセス
糖
バイオマス
ケミカルプロセス
乳酸
ポリ乳酸
バイオポリマー
CO2
燃焼
リサイクル
リユース
CO2固定
エネルギー使用
ポリ乳酸等のバイオポリマー
⇒ 長期間のCO2固定が可能となる
3
バイオプロパノール発酵生産の目的
化石資源依存型社会から資源循環型社会へ
バイオプロセス
糖
バイオマス
ケミカルプロセス
プロパノール
プロピレン
ポリプロピレン
化石資源
年間生産量
50Mt-PP
約 2 kg-CO2/kg
バイオプロピレン
CO2
約 5 kg-CO2/kg
ナフサ分解法
燃焼
リサイクル
リユース
CO2固定
エネルギー使用
すでにポリマーとして普及しているポリプロピレンの生産
⇒ バイオマスからのプロパノール生産プロセスの開発
4
既存の組換えE. coliを用いたプロパノール生産系
Glucose
2x
Pyruvate
CO2
2x
Acetyl-CoA
ABE発酵菌の
イソプロパノール
生合成系を
E. coliに移植
Glycolysis
GAP
DHAP
Acetoacetyl-CoA
Acetate
Acetyl-CoA
2 x Pyruvate
CO2
Propanol
Acetoacetate
CO2
Max 1.0 mol/mol glucose
Acetone
Hanai, T. et al., Appl. Environ. Microbiol., 73:7814-8 (2007)
Jojima, T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 77:1219-24 (2008)
Shen, CR. et al., Metab. Eng., 10:312-20 (2008)
Atsumi, S. et al., Appl. Environ. Microbiol., 74:7802-8 (2008)
Isopropanol
5
従来技術とその問題点
ABE発酵菌のイソプロパノール生合成経路を移
植した組換え大腸菌を用いる方法があるが、
生合成経路中にCO2放出反応があり、
大腸菌の生育等に必要なエネルギー等を
差し引くと、
グルコースからの対糖収率が最大でも0.6〜0.7
モル／モル程度にとどまると考えられる。
6
新規1-プロパノール発酵生産経路の概略
Glucose
Glucose
Glycolysis
GAP
Glycolysis
DHAP
GAP
DHAP
Pi
MG
NAD(P)H
NAD(P)H
To TCA cycle
Reducing power
ATP
1-Propanol
Max 2.0 mol/mol glucose
HA
1×Glucose + 0.375×O2
1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP
LA
NAD(P)H
NAD(P)H
Max 1.25 mol/mol glucose
1,2PD
CoB12
NAD(P)H
1-Propanol
H2O
PA
CO2放出のない
新たなプロパノール
生合成系を設計
7
新技術の特徴・従来技術との比較
• すでに報告のあるイソプロパノール発酵技術
とは異なり、CO2放出を伴わないプロパノール
生合成経路を設計。
• 対糖収率において、従来技術より1.5〜2倍の
向上が期待できる。
• バイオマス由来のポリプロピレンのCO2排出
量は、化石資源由来のものの半分以下。
8
新規1-プロパノール発酵生産経路の概略
Glucose
Glucose
Glycolysis
GAP
Glycolysis
DHAP
GAP
DHAP
Pi
MG
NAD(P)H
NAD(P)H
HA
1-Propanol
1×Glucose + 0.375×O2
1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP
LA
NAD(P)H
To TCA cycle
Reducing power
ATP
NAD(P)H
Max 1.25 mol/mol glucose
1,2PD
CoB12
NAD(P)H
1-Propanol
H2O
PA
CO2放出のない
新たなプロパノール
生合成系を設計
9
グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種
Sporobolomyces salmonicolor由来
Aldehyde reductase II
(arII)
Escherichia coli由来
Glycerol dehydrogenase
(gldA)
Glucose
(S)-LA
(S)-1,2-PD
DHAP
MG
HA
(R)-1,2-PD
Escherichia coli由来
Methylglyoxal synthase
(mgsA)
(R)-LA
10
グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種
250
Ptac
200
Lactate
Ptac
pKKArMeGe
(5039 bp)
mgsA
Ptac
gldA
Concentration (mM)
arII
150
100
Acetate
EtOH
Formate
50
Succinate
1,2-PD
0
Vector
100 mM Glucose, 48 hr
Consumed glucose is 100 mM
Aeration
Produced
1,2-PD (mM)
pKK
223-3
pKK
ArMeGe
Aerobic
N.D.
1.3
pKK
223-3
pKK
ArMeGe
Microaerobic
N.D.
20.6
11
グルコースから1,2-PDを生産する菌株の育種（まとめ）
Glucose
Sporobolomyces salmonicolor由来
Aldehyde reductase II
(arII)
DHAP
Escherichia coli由来
Methylglyoxal synthase
(mgsA)
MG
HA
1-Propanol
1,2-PD
Escherichia coli由来
Glycerol dehydrogenase
(gldA)
Glucoseから1,2-Propanediolを発酵生産する菌の育種を目的として、想定経路を構
築し、各反応を触媒する酵素遺伝子のスクリーニングによる選抜を行った。
これら酵素遺伝子を導入した組み換えE. coliをGlucose含有培地で微好気的に培
養することにより、100 mM (= 18.0 g/L)のGlucoseより20.6 mM (= 1.57 g/L)の1,2Propanediolを培養液中に蓄積した。
12
新規1-プロパノール発酵生産経路の概略
Glucose
Glucose
Glycolysis
GAP
Glycolysis
DHAP
GAP
DHAP
Pi
MG
NAD(P)H
NAD(P)H
HA
1-Propanol
1×Glucose + 0.375×O2
1.25×1-Propanol +1×H2O + 2.25×CO2 + 1.75×ATP
LA
NAD(P)H
To TCA cycle
Reducing power
ATP
NAD(P)H
Max 1.25 mol/mol glucose
1,2PD
CoB12
NAD(P)H
1-Propanol
H2O
PA
CO2放出のない
新たなプロパノール
生合成系を設計
13
1,2-PDを1-プロパノールへ変換する菌の探索
Glycerol
3-Hydroxypropionaldehyde
Glycerol dehydratase
1,2-PD
1,3-Propanediol
1,3-Propanediol oxidoreductase
Propionaldehyde
1-Propanol
14
Conversion of 1,2-PD to 1-propanol using Shimwellia blattae ATCC33430
60
60
25
48
20
40
30
1,2-PD
20
10
1-Propanol
0
Glc
Gly
Glc+Gly
Culture conditions
M9 minimum medium containing
5 g/L Yeast extract
10 g/L CaCO3
50 mM 1,2-PD
Sugar :
100 mM (= 18 g/L) Glucose
and/or
200 mM (≒ 18 g/L) Glycerol
36
15
Glucose
Glycerol
24
10
1-Propanol
12
5
0
0
0
37ºC, 48 hr
Glucose, Glycerol (mg/mL)
1,2PD
!-Propanol, 1,2-PD (mM)
Concentration (mM)
50
20
40
60
Time (h)
80
100
15
1,2-PDを1-プロパノールに変換する菌株の育種
dhaK
dhaN dhaM dhaL
dhaD
dhaR
dhaH
dhaT dhaI
dhaG
dhaB dhaC
dhaF
dhaE
Ge
Ge
ne
ne product
Ge
Ge
ne
ne product
dhaK
Dihydroxyace
dhaG
Glyce
tone kina
rol de
se
hy
dhaN
Phosphoeno
dhaT
lpyruva
1,3-Pro
te
pa
-pro
ned
t
dhaM
Dihydroxyace
dhaI
Ade
tone
no
kina
syl se
tran
dhaL
Hypothetica
dhaB
l Glyce
protein
rol dehy
dhaD
Glycerol de
dhaC
hydro
Glyce
ge
ro
na
l de
se
hy
dhaR
Glycerol me
dhaE
ta
Glyce
bolism
rolo
de
pe
hy
ro
dhaH
Adenosyl tra
dhaF
nsfe
Glyce
ra
ro
se
l de
sma
hy
l
1,2-PD
DhaT
PA
1-Propanol
Inactivation
CoB12
DhaBCE
(apoenzyme)
DhaBCE
(inactive)
AdoCbl
PPPi
DhaFG
DhaHI
DhaBCE
(holoenzyme)
ATP
Cbl(I)
Cobalamin reductase(s)
NAD(P)+
NAD(P)H
Ado-H
ATP
ADP
X-Cbl
Toraya, T., Cell. Mol. Life Sci., 57:106-27 (2000)
16
1,2-PDを1-プロパノールに変換する菌株の育種
60
1,2-PD
40
30
1-Propanol
1,2-PD
20
PA
10
0
dhaBCE
dhaFG
dhaHI
dhaT
OD660
○
×
×
×
1.3
○
×
×
○
1.2
○
○
×
×
0.7
100 mM
50 mM
5 μg/mL
96 hr
○
×
○
×
1.0
Glucose
1,2-PD
CoB12
○
○
○
×
0.3
○
○
○
○
1.2
Concentration (mM)
Concentration (mM)
50
1-Propanol
pRSF_Eb
DhaBCEF
pCDF_Eb
DhaITGH
×
○
○
○
×
○
100 mM Glucose, 70 mM 1,2-PD,
5 μg/mL CoB12, 72 hr
17
組換えE. coliを用いた1-プロパノールの発酵生産
20
200
Concentration (mM)
○
pKKArMeGe
Glucose
Consumed
glucose
1,2-PD
1-Propanol
126.1
19.4
N.D.
16
160
12
pKKArMeGe
pCDF_EbDhaITGH
pRSF_EbDhaBCEF
×
120.6
17.2
N.D.
○
115.1
1.9
16.9
200 mM Glucose, 5 μg/mL CoB12, 96 hr
培養時間
消費グルコース
1-プロパノール生成
対グルコース変換率
144 h
132.6 mM (≑23.9 g/L)
19.9 mM (≑1.2 g/L)
0.15 mol/mol (0.05 g/g)
120
1-Propanol
8
80
4
Glucose (mM)
CoB12
1-Propanol, 1,2-PD (mM)
Plasmids
40
1,2-PD
0
0
0
50
100
Time (h)
150
18
想定される用途
• バイオマスからのプロピレン・ポリプロピレン
生産
• バイオマス由来の燃料添加剤の発酵生産
• バイオマス由来の多目的溶媒の発酵生産
19
実用化に向けた課題
• グルコースから1-プロパノールの生産を確認。
しかし、1-プロパノールの収量・対糖収率が不
十分。
• 現在、1-プロパノール生合成経路の強化や副
産物への変換経路の削除を検討中。
• 1-プロパノールの発酵生産条件の最適化に
ついても検討中。
20
企業への期待
• バイオマスからのプロピレン生産を目指したプ
ロパノール発酵技術の共同開発。
• 発酵生産技術の開発経験を持つ企業との共
同研究を希望。
• 本技術によるバイオマス由来のプロパノール
のプロピレン製造以外への用途開発。
21
本技術に関する知的財産権
•
•
•
•
発明の名称 ：1-プロパノールの製造方法
出願番号 ：特願2007-298136
出願人
：協和発酵ケミカル他
発明者
：片岡道彦、浦野信行、清水昌
22
産学連携の経歴
• 1991年-1999年 第一ファインケミカル社と共同研究
☞ D-パントラクトンの酵素法による生産（1999年）
• 1995年-2000年 カネカ社と共同研究
☞ キラルアルコールの酵素法的生産（2000年）
• 2007年-2011年 文科省-JST ターゲットタンパクプ
ログラムに採択
• 2012年- JST-ALCAプロジェクトに採択
23
お問い合わせ先
大阪府立大学
産学官研究連携戦略室 コーディネータ
野村 幸弘
ＴＥＬ
072－254－ 8263
ＦＡＸ
072－254－ 7475
e-mail [email protected]
24