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視覚障害治療のための
可視光に感受波長を持つ
光活性化陽イオンチャネルタンパク質
岩手大学 工学部 応用化学・生命工学科
教授
冨田 浩 史
特任准教授 菅野 江里子
1
失明を来す疾患とその要因
視覚・・・・外界からの情報の80％
米国基準
良い方の視力0.1以上0.5未満
良い方の視力0.1以下
：ロービジョン
：失明
本邦の視覚障害者の数： 約164万人
2030年には200万人に！！
(2009年：日本眼科医会資料)
視覚障害者
一旦、失明に至ると、視
機能を回復させる治療法
は無い
視覚障害がもたらす社会損失額
失明者数は18.8万人
8.8兆円
2
網膜の構造と疾患
脳へ
神経節細胞
（ON, OFF, ON-OFF)
内顆粒層
（アマクリン、双極、
水平、ミューラー細胞）
光受容細胞
（視細胞：桿体、錐体）
失明を来たす疾患 (日本)
1. 緑内障
2. 糖尿病網膜症
3. 網膜色素変性症
4. 加齢黄斑変性症
神経節細胞、視神経
進行により異なる
視細胞（桿体）
第一位
視細胞（錐体）
3
網膜色素変性症
厚生省特定疾患
頻度： 1/4000～8000人
原因： 視細胞、網膜色素上皮細胞などの
光受容に関係する遺伝子の変異
脳（視覚野）
映像、光
外側膝状体
原因遺伝子: 135
有効な治療法はない
Point !!
視細胞が完全に消失して
も他の神経細胞は残存
視神経
入
力
脳に情報を送る
神経節細胞
視細胞の情報を受け
取り、神経節細胞に
その情報を伝達
変性
光を受け取る
唯一の細胞
残存する神経細
胞を利用して視
覚情報を伝達
光受容細胞を
作り出し移植
・人工網膜
・遺伝子治療
・幹細胞移植
（iPS細胞）
視細胞
4
Embryonic Stem Cells
幹細胞
・移植後、生来の
シナプスが再構成
されるか不明
・拒絶反応
iPS細胞・・・自身の
細胞から作るため、拒
絶反応は回避できる。
しかし、同一の遺伝子
変異を持つため、利用
できない。視細胞に分
化させる前に変異を修
復し、視細胞を作る研
究が進められている。
Nakano T, Sasai Y,et al., Cell Stem
Cell, 2012
Osakada F, Takahashi M, et al,
Nature Biotec.2008
5
チャネルロドプシン－２(ChR2)
池や沼に住む走光性の緑藻類
葉緑体を持ち、光合成によりエネルギーを作る
クラミドモナス
鞭
毛
眼
点
葉緑
体
眼点で光を受容し、鞭毛運動により移動する
眼点に存在する光受容タンパク質
チャネルロドプシン-2
光受容体 + 陽イオン選択的チャネル
5-10
m
light 神経細胞へ遺伝子導入
Na+
Nagel G. et al. PNAS. 2003
透過性 ↑
EC
１つの遺伝子を導
入することで光受
容能を与えること
ができる
membrane
IC
脱分極
神経節細胞
脳へ
視覚情報伝達
＋
光受容能
二次ニューロン
変性
活動電位発生
6
従来技術とその問題点 (1/2)
緑藻類クラミドモナスの光活性化陽イオン
チャネルチャネルロドプシン-2(ChR2)
神経細胞へ遺伝子導入
light
Na+
透過性
↑
EC
membrane
IC
活動電位発生
ChR2遺伝子を神経細胞に
導入し発現させることで、
神経細胞に光受容能を与
えることができる。
脱分極
7
従来技術とその問題点
(２/2)
ChR2遺伝子導入
二次ニューロン
残存する網膜
神経細胞に
ChR2遺伝子を
導入し光受容
能を賦与
Arrenberg AB, et al, Science. 2010
変性
失明
Tomita H, et al, IOVS, 2007
問題点：ChR2の感受波長が
青色に限定される
可視光に感受波長を持つ光活性化陽イ
オンチャネルタンパク質を開発
Osawa S, et al, PLOS ONE, 2013
8
遺伝子導入用ベクターの選択
AAV-ChR2V
アデノ随伴ウイルスベクター
遺伝子治療用ベクターとして実績豊富
2型は、神経節細胞に高親和性
CAG ChR2 (1-315AA) Venus
硝子体内投与
5 μl （1012～1013 particles / ml）
視機能評価
遺伝盲ラット
電気生理学的評価(VEP)
Visually Evoked Potential
導入効率評価
行動解析
光
刺
激
光刺激に伴う視覚野の
電位変化
回転する縞模様
に対するラット
の追従行動
9
神経節細胞への
遺伝子導入効率
青色蛍光（神経節細胞）
緑色蛍光（ChR2V）
両方で標識された細胞数を計測
Merged
The number of cells (cells / mm2)
全神経節細胞数の27.7±9.4 ％
ヒト：1００万個の神経節細胞
2000
眼内へウイルスベクターを1回注入する
と約28万個の細胞が光受容細胞になる
1500
1000
500
0
Ganglion cells Double labeled cells
人工網膜
・16画素
（Max:1000画素）
・4-5cells/１電極
・擬似光覚
・手術時間3-4時間
ChR2遺伝子治療
・28万画素
・個々が光受容細胞
・細胞の興奮
・１０分程度
10
視覚誘発電位
正常ラット
50 μV
入力
ChR2
神経節細胞層
(GCL)
内顆粒層
視細胞層
（光受容細胞）
視覚野
30 ms
P1
遺伝盲ラット
外側膝状体
視神経
遺伝子導入後
by-pass
(20-25ms)
光反応が回復！！
潜時短縮
Tomita H., et al., IOVS, 2007
神経節細胞が直接、
光に応答
11
行動解析
Tomita H., et al., Exp. Eye Res.2010
首振り回数
30
rdy/rdy
rdy/rdy - ChR2V
+/+
25
20
15
10
角速度
40
RCS (+/+)
RCS (rdy/rdy)-ChR2V
15
R2= 0.6339
R2= 0.7415
30
angle speed
35
angle displacement (degree)
The number of movement
40
角度変位量
10
2
R = 0.3166
5
R2= 0.2322
20
10
RCS (+/+)
RCS (rdy/rdy)-ChR2V
5
0
0.5
2.0
4.0
rpm
control
8.0
0
0
2
4
6
rpm
8
10
0
0
2
4
6
8
10
rpm
AAV-ChR2V
青-黒の縞模様を
弁別できる
12
遺伝子改変動物の作製
神経節細胞にChR2が発現
Thy-Iプロモーターの下流にChR2Vを導入
ln 1
ln 4
ln 5
ln 7
ln 4
Tomita H., et al, 2009, PLoS ONE
13
オプトモーターを用いた視機能検査
・各空間周波数
・コントラスト
感度測定
Top View
Display
platform
Display
Display
Display
mirror
blue
black
sine wave
14
遺伝子改変動物の視覚特性
TGラット
（視細胞無）
Contrast Sensitivity
コントラスト
100
悪い
良い
縞模様少ない
** **
ChR2V+/LD - ChR2V+/-
TGラット
（視細胞有）
10
1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Spatial Frequency (c/d)
0.6
縞模様多い
15
ChR2によって得られる視覚
light
light
light
16
臨床応用に向けた取り組み
免疫反応
no severe immune
titration of AAV2
response
antibody
titration of
ChR2 antibody
T-cell ratio
Sugano E, et al Gene Therapy, 2010
17
遺伝子導入後の視覚誘発電位の変化
Normal
50 μV
30 ms
P1
RCS rat (Genetically blind rat)
before
after ChR2 transfer
視覚誘発電位の回復
Sugano E, Gene Therapy, 2010
18
ChR2の波長感受性
1 .2
R C S -C h R 2 V
r e la t iv e s e n s it iv it y ( % )
n o n - d y s t r o p h ic R C S
1 .0
0 .8
0 .6
0 .4
0 .2
0 .0
350
400
450
500
550
600
650
w a v e le n g th ( n m )
Tomita H, Exp Eye Res, 2010
19
新規チャネルロドプシンの開発
120
ClChR2
VChR2
ClChR2
ボルボックスChR1の発見
Zhang F., et al. Nat. Neurosci., 2008
( V)
amplitude m
100
80
60
VChR1
40
20
0
0.001
0.01
0.1
1
10
blue LED ( mw / 2cm
)
培養し、volChR1
cDNAをクローニン
Volvox carteri グ
クラミドモナスChR2 ボルボックスChR1
20
VChR1
anti-β-actin
control
クラミドモナス由来チャネルロドプシン-1 (ChR1)
N末２３個のアミノ酸 → 細胞外への輸送シグナル
anti-GFP
mVChR1
原因：細胞膜への発現効率
whole cell lysates
membrane fraction
anti-GFP
a
b
c
VChR1
改変型VChR1
mVChR1
VChR1
control
anti-cadherin
mVChR1：多波長感受性
国内：登録済み
米国：登録済み
PCT/JP2010/063786
ＪＳＴ支援
21
視覚誘発電位測定
行動解析
ChR2V
mVChR1
1.0
c y c le s p e r d e g r e e
0 .4
0 .3
0 .2
0 .1
0.0
400
450
500
550
600
650
ac
k
ck
re
d-
bl
la
-b
ye
llo
w
nee
0.5
gr
ue
-b
bl
la
ac
k
ck
0 .0
bl
relative sensitivities
( to 468 nm)
1.5
0 .5
700
nm
Tomita H et al, Mol Therapy, 2014
22
安全性評価（遺伝盲ラット：non-GLP）
ChR2（青型） → 免疫学的、組織学的に重篤な副作用所見無し
mVChR1では？
網膜変性症ラット （遺伝子導入後10ヶ月）
・血液一般、生化学検査（WBC, RBC, GOT, ALT, etc) → 無
RBC
WBC
80
50
40
30
20
90
800
700
600
300
ALT (IU/L)
60
AST (IU/L)
70
200
Venus
70
60
50
0
400
PBS
80
100
500
10
0
ALT
100
400
Number x 10E4 / ul
Number X10E2/ ul
GOT
900
PBS
YR
Venus
YR
PBS
Venus
YR
40
PBS
Venus
YR
Injection
normal:4500-6030
・抗体価測定
・組織学的評価
200000
anti YR peptide (pg/ml)
2000
PBS
Venus
mVChR1
1500
1000
500
0
0
0.5
2
4
6
10 antibody
Months after injection
20m
23
試験物（ＡＡＶ-mVChR1）の規格
tria l s a m p le
a m p lit u d e (  V )
L a b o r a tr y m a d e
150
100
50
約5倍
約5倍
0
B lu e
G re e n
s tim u lu s c o lo r
試作品： 1 ×
品質検査項目（225cm2 flask 120本から製造）
・力価（qPCR・ゲノムコピー数）
・純度確認試験（SDS-PAGE・銀染色）
・無菌試験（培養法）
・マイコプラズマ否定試験
・エンドトキシン試験
・mVChR1の塩基配列確認
1011
vg/ml
安定性試験
・mVChR1抗体作製
Marker
試作品
本製造
大学内製造品
200
試作品： 5 × 1011 vg/ml 必要
高濃度AAVの生産法検討へ
24
安全性試験（マーモセット：non-GLP）
右：無処置 左：投与 （n=3）
１．無処置群
２．PBS投与群
３．低用量群 (1×1011 vg/ml)
４．高用量群 (5×1011 vg/ml)
検査項目
・一般状態観察
・血液検査（一般、生化学）
・眼底検査
・電気生理学的検査
（網膜電図、視覚誘発電位）
・排泄物中のウイルス濃度
b /a
c o n tr o l
10
Low
8
H ig h
6
4
2
o
h
H
ig
w
o
L
B
P
n
tr
o
S
l
0
c
a m p lit u d e ( b /a )
PBS
25
実用化に向けた課題
GLP試験予定
失明者の視覚を再建するため
の治療薬として共同開発
・ラットを用いた単回投与毒性試験（GLP）
期間：
3か月
動物：雌雄SDラット
・ウサギを用いた単回投与毒性試験（GLP）
期間：
3か月
動物：雌雄ウサギ
・マウスを用いた造腫瘍試験
期間：3か月
動物：雌雄SCIDマウス（1群12匹×3群； 2用量+対照群）
・安全性薬理試験 中枢、心血管系および呼吸器に対する作用
期間：24時間
動物：雄イヌ（マーモセット）（1群1匹×3群； 2用量+対照群）
26
謝
辞

日本網膜色素変性症協会

成田アニマルサイエンス研究所

東北大学病院臨床研究推進センター

宮城県眼科医会

文部科学省科学研究費補助金
萩森一郎先生
（基盤B, C, 若手研究B, 萌芽研究）

（独）医薬基盤研究所 (H22～26)

文部科学省橋渡し研究加速ネットワーク（H26～28）
27
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称
• 出願番号
• 出願人
• 発明者
：手続き中
：手続き中
：国立大学法人岩手大学
：冨田浩史、菅野江里子
※特許出願から1.5年未満の未公開特許情報を含んだ説明会ですので、情報の取
り扱いに十分ご注意下さい。公開する情報の範囲につきましては、特許出願人（知
財本部、TLO等）とご相談ください。
28
お問い合わせ先
岩手大学 研究推進機構
プロジェクト推進部門 知財Gr.
副機構長・教授 対馬正秋
ＴＥＬ ０１９－６２１－６４９４
ＦＡＸ ０１９－６０４－５０３６
e-mail [email protected]
29