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Cytometric Bead Arrayとは
・ 蛍 光 強 度 の 違 う 数 種 類 の Beadsを使用し、フローサイトメター
を用いて溶液中の蛋白質濃度を測定する方法
・測定対象はサイトカインやイムノグロブリンなど
・多項目を同時に測定可能
・ サ ン プ ル 調 製 は 、ELISAと同様のサンドイッチ法
CBA KITの種類
・ヒトTh1/Th2サイトカイン CBAキット
IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF-α IFN-γ
・ヒトTh1/Th2サイトカイン CBAキットⅡ
IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 TNF-α IFN-γ
・ヒトInflammation CBAキット
IL-1β IL-6 IL-8 IL-10 TNF-α IL-12p70
・マウスTh1/Th2サイトカイン CBAキット
IL-2 IL-4 IL-5 IFN-γ TNF-α
・マウスImmunoglobulin Isotyping CBAキット
マウスκ,λ IgG1 IgG2a IgG2b IgG3
IgA IgM IgE
利点（ELISAとの比較）
・１Test当り、1 測 定 項 目 約 300回 の ア ッ セ イ に 相 当 す る
・サンプル量が １／６（１サンプルでｻｲﾄｶｲﾝ６種類測定）
・測定時間が短く（約５時間）、６種類の測定結果が得られる
・測定範囲が ２０−５，０００ pg／ ｍＬと広範囲
作業効率の改善と低コスト化
1
Human Th1/Th2 cytokine
CBA Kit (BD-550749)
・培 養 上 清 、 血 清 、 血 漿 中 の ６ 種 類 の
ﾋﾄｻｲﾄｶｲﾝ
（IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α , IFN-γ )
の 濃 度 をFCMを 用 い て同 時 に 測定できるキット
測定原理
原理(1)
• 測定原理はELISAと同様の抗原抗体反応
• ELISAでは （吸光度測定）
Capture抗体：
96穴プレートにコートし、
Detection抗体-B/SA-Enzymeで発色
• CBAでは （蛍光強度測定）
Capture抗体：
ビーズにコート（６種類）
Detection抗体-蛍光色素でFCM解析
2
原理(2)
ELISA
CBA
基質
蛍 光 色 素 標 識 Detection抗 体
SA-HRP
Y
サイトカイン
蛍光強度測定
（FCM）
PE
Ｙ
Detection antibody
(ビオチン標識抗体)
抗体
Ｙ Ｙ
Ｙ
発色
Capture antibody
Y
抗原
吸光度測定
サイトカイン
ビーズ
96 well
microplate
サ イ ト カ イ ン 抗 体 ( C a p t u r e 抗体 ) を
コートしたビーズ
原理(3)
Captureビ ー ズ の 蛍 光 強 度 (FL3)
IL-2 > IL-4 > IL-5 >IL10 > TNF-α > IFN-γ
Y
PE
PE
IL-10
Y
Y
Y
Y
PE
FL2：
cytokine 濃 度
ビーズ
IL-5
Y
PE
Y
PE
Y
Y
Y
Y
IFN- γY
TNF-α
PE
Y
PE
Y
Y
Y
IL-4
Y
抗原
Ｙ
抗体
Ｙ Ｙ
Ｙ
IL-2
Y
Cytokine capture beads と PE-conjugated
detection antibodyで cytokineを サンドイッチ
FL3: 6種 の 蛍 光 強 度
（ ｻ ｲ ﾄ ｶ ｲ ﾝ の 種 類 ）
FCM表 示
FL2-H/FL3-H Dot Plot
IL-2
IL-4
IL-5
IL-10
TNF-α
IFN-γ
サイトカインの
種 類 はFL3-H
3
FCM表 示
FL2-H/FL3-H Dot Plot
IL-2
IL-4
IL-5
IL-10
TNF-α
サイトカインの
IFN-γ
種 類 はFL3-H
濃 度 はFL2-H
Cytokine 濃 度
キット内容
Kit Contents
( Store the following items at 4° C)
•
•
A1 : Mouse IL-2 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
A2 : Mouse IL-4 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
•
•
•
A3 : Mouse IL-5 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
A4 : Mouse IL-10 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
A5 : Mouse TNF-α Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
•
•
•
A6 : Mouse IFN-γ Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
B : Mouse Th1/Th2 PE Detection Reagent: 1 vial, 4 ml
C : Mouse Th1/Th2 Cytokine Standards: 2 vials, 0.2 ml lyophilized
•
•
•
D : Cytometer Setup Beads: 1 vial, 1.5 ml
E1 : PE Positive Control Detector: 1 vial, 0.5 ml
E2 : FITC Positive Control Detector: 1 vial, 0.5 ml
•
•
F : Wash Buffer: 1 bottle, 130 ml
G : Assay Diluent: 1 bottle, 30 ml
注) PE : Phycoerythrin, FITC : Fluorescein Isothiocyanate
4
Kit Contents
(A) Capture Beads
Human cytokine capture beads (A1-A6)
• A1. Mouse IL-2 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
• A2. Mouse IL-4 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
• A3. Mouse IL-5 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
• A4. Mouse IL-10 Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
• A5. Mouse TNF-α Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
• A6. Mouse IFN-γ Capture Beads: 1 vial, 0.8 ml
• 70-test / each specific capture beads
• 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可
• ５ 種 類 混 合 し 、 50 µl/testで 使 用
• 使用前に攪拌すること
FL3-H
brightest
ＹＹＹ
6種 類 の ビ ー ズ
Kit Contents
(B) Detection antibody
Human Th1/Th2 PE Detection Reagent: 1 vial, 4 ml
•
•
PE-conjugated anti-human IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α , IFN-γ
70-test/vial,使 用 量 ：50 µl/test, 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可
(C)Standard
Human Th1/Th2 Cytokine Standards: 2 vials, 0.2 ml lyophilized
•
•
Assay diluent 0.2mlに 溶 解 10X bulk standard (50ng/ml)
(Top standard 5000pg/mlの 10倍 濃 度 液 )
溶 解 後 は 4℃ 保 存 で 12時 間 以 内 に 使 用
Kit Contents
(D) Instruments setup beads
D. Cytometer Setup Beads: 1 vial, 1.5 ml
装 置 の 初 期 設 定 用 (PMT voltages & compensation)
30-test /vial
使 用 量 ：50 µ l/test
4℃ 保 存 、 凍 結 不 可
注）PMT : Photomultiplier （光電子倍増管）
5
Kit Contents
(E) Instruments setup reagents
E1. PE Positive Control Detector: 1 vial, 0.5 ml
• PE-conjugated antibody control
• 装 置 の 初 期 設 定 用 (compensation)
• Cytometer setup beadsと 共 に 使 用
• 10-test/vial,使 用 量 ：50 µl/test, 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可
E2. FITC Positive Control Detector: 1 vial, 0.5 ml
• FITC-conjugated antibody control
• 装 置 の 初 期 設 定 用 (compensation)
• Cytometer setup beadsと 共 に 使 用
• 10-test/vial,使 用 量 ：50 µl/test, 4℃ 保 存 、 凍 結 不 可
Kit Contents
(G,F) Buffer reagents
G. Wash Buffer: 1 bottle, 130 ml
•
•
Standards お よ び test sample の 希 釈 に 使 用
4℃ 保 存
F. Assay Diluent: 1 bottle, 30 ml
•
•
•
蛋 白 質 、 界 面 活 性 剤 を 含 む PBS (phosphate buffered saline)
ビーズの洗浄、再懸濁に使用
4℃ 保 存
その他必要品
• FCM (CellQuest, FACSComp)
• Falcon tube (12 x 75 mm)
• BD CBA Software
(Macintosh computer, Microsoft Excel)
• MAC（
G3以上）
• BD CaliBRITETM3 beads
6
CBA に よ る ｻ ｲ ﾄ ｶ ｲ ﾝ 測 定 法 の 流 れ
① 測 定 ｻ ﾝ ﾌ ﾟ ﾙ と FCM測 定 条 件 設 定 用 b e a d s の 準 備
測定ｻﾝﾌﾟﾙの調製（希釈等）
Capture beads混 合 液 ＋ 測 定 ｻ ﾝ ﾌ ﾟ ﾙ ＋ PE標 識 検 出 用 抗 体 の 反 応
FCMの Setup beads の 調 製
② FCM機 器 設 定 と サ イ ト カ イ ン 測 定
CaliBRITE3 beadsに よ る 機 器 設 定
FACSCompを 使 用
上 記 Setup beads A,B,Cに よ る 機 器 の 条 件 設 定
CBA software の 機 器 設 定 Templateを 使 用
サイトカイン量の測定
データ解析
Acquisition Template を 使 用
ﾃﾞｰﾀ解析用ｿﾌﾄｳｪｱを使用
測定法概略
C a p t u r e b e a d s混 合 液 ( 5 0µl )
S T N ま た は 検 体 (50 µl )
PE 標 識 検 出 用 抗 体 (50 µl )
FCM Setup beadsの 調 製
Tube A : setup beads 50µ l
Tube B : setup beads 50µl
遮光下、室温３時間反応
+ FITC- Positive Control Detector 5 0µl
Tube C : setup beads 50µ l
ビ ー ズ を wash buffer 1mlで 洗 浄
200g x 5 min.遠 心
Supernatant を 注 意 深 く aspirate
wash buffer 300µ lで 再 懸 濁
+ PE- Positive Control Detector 5 0µl
遮 光 下 、 室 温 30分 反 応 後
wash bufferで 500µ lに 調 製
FCMに て 測 定
Acquisition template example
7
Analysis of sample data
BD CBA Softwareを用 い てdataを 解 析 す る
1. FACS file data を BD CBA Softwareに transfer
2. Standard と Sampleの 2つ の フ ォ ル ダ ー を 作 成
3. FACS file data を そ れ ぞ れ の フ ォ ル ダ ー に 移 す
4. Software を 用 い て dataを 解 析 す る
測定性能
Assay Range
20 - 5,000 pg/ml
Sensitivity
Assay Sensitivity
cytokine Median Fluorescence
Mean ± S.D.
IL-2
3.3 ± 0.2
IL=4
2.3 ± 0.2
IL-5
2.6 ± 0.2
IL-10
2.4 ± 0.2
T N F -α
2.0 ± 0.2
IFN- γ
2.1 ± 0.3
Sensitivity
(pg/ml)
2.6
2.6
2.4
2.8
2.8
7.1
注：background MFI(N=20)の mean+2SDを示す濃度 （4- parameter curve より求めた）
8
Precision
Intra-assay Precision
cytokine
IL-2
IL-4
IL-5
IL-10
TNF-α
IFN-γ
N=10
実測値(pg/ml)
Mean ± SD
71 ± 1
534 ± 23
2160 ± 74
85 ± 3
592 ± 25
2488 ± 108
78 ± 2
587 ± 29
2456 ± 150
82 ± 2
592 ± 15
2486 ± 86
81 ± 2
592 ± 22
2504 ± 126
78 ± 3
528 ± 21
2194 ± 65
C.V.
(%)
2
4
3
4
4
4
3
5
6
2
2
3
3
4
5
4
4
3
cytokine
IL-2
IL-4
IL-5
IL-10
Inter-assay Precision
実測値(pg/ml)
C.V.
Mean ± SD
(%)
77 ± 7
9
627 ± 29
5
2509 ± 247
10
74 ± 5
7
601 ± 40
7
2553 ± 147
6
80 ± 4
5
615 ± 39
6
2560 ± 165
6
81 ±
631 ±
2556 ±
TNF-α
79 ±
627 ±
2564 ±
IFN-γ
69 ±
610 ±
2518 ±
N=8 (duplicate x 4 )
5
45
189
4
31
131
6
40
139
6
7
7
5
5
5
9
7
6
Recovery
Linearity
9
Specificity
文献例
•
Heparin Induces Differntiation of CD1a+ Dendritic Cells from
Monocytes:Phenotypic and Functional Characterization
Chang-Qing Xia and Kuo-Jang Kao
J Immunology 2002; 168:1131-1138
•
Human NKT Cells Mediate Antitumor Cytotoxicity Directly by
Recognizing.Target Cell CD1d with Bound Ligand or Indirectly
by Producing IL-2 to Active NK Cells
Leonid S. Metelitsa, Olga V.Naidenko, Anita Kant, Hong-Wei
Wu, Matthew J.Loza,Bice Perussia, Mitchell Kronenberg, and
Robert C.Seeger
J Immunology 2001; 167:3114-3122
Simultaneous measurement of six cytokines in a single sample
of human tears using microparticle-based flow cytometry :
allergics vs.non-allergics, E.B.Cook et al,
Journal of Immunological Methods, 254, 109-118,2001
•
ありがとうございました
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