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新発売！
TM
PrimeFlow RNA Assay
フローサイトメトリー　mRNA 検出試薬
製品概要
eBioscience/Affymetrix 社の「PrimeFlow RNA Assay」は、全く新しい in situ Hybridization 法で、独自のプローブ設
計と branched DNA 法によるシグナル増幅により、数百万のシングルセルにおける RNA とタンパク質の検出が可能
です。PrimeFlow RNA Assay は、フローサイトメトリーに対応した高感度 in situ Hybridization 試薬で、3 種類の蛍
光色素により最大 3 遺伝子を同時に検出します。キットは、専用の 1.5 mL チューブを使用して浮遊細胞（1 サンプ
ルあたり 1-5 x 10^6 個）の染色に使用しやすいパッケージです。
Target Probe と
bDNA の構造
プローブタイプと蛍光チャネルの選択
検出遺伝子の
発現量
Low
Medium to High
Medium to High
Probe Type/ 蛍光ラベル
FlowCytometer レーザー
蛍光チャネル
Type 1 / Alexa Fluor 647
Type 4 / Alexa Fluor 488
Type 6 / Alexa Fluor 750
633
488
633
APC, AF647,eFluor 660
FITC,AF488
APC-Cy7,AF750,APC-eFluor 780
特長
• 感染細胞におけるウイルス RNA の検出
• シングルセルレベルで遺伝子の異種性
• 細胞サブセットにおけるノンコーディング RNA の検出
(heterogeneity) の観察
• 抗体が利用できない場合、mRNA の発現レベルを解析
• 同じ細胞で RNA とタンパク質の両方の変動比較
データ例
Granzyme B
RNA vs CD8
Protein vs CD8
Protein vs RNA
RNA vs CD8
Protein vs CD8
Protein vs RNA
Ki-67 mRNA Alexa Fluor
488
®
488
CD8 PE-eFluor ® 610
GrzB Pr otein PE-Cyanine7
GrzB Pr otein PE-Cyanine7
750
®
GrzB mRNA Alexa Fluor
CD8 PE-eFluor ® 610
CD8 PE-eFluor ® 610
®
Ki-67 Pr otein eFluor® 450
Ki-67 mRNA Alexa Fluor
®
Ki-67 Pr otein eFluor® 450
488
Unstimulated:
CD8 PE-eFluor ® 610
GrzB mRNA Alexa Fluor
®
750
®
750
CD8 PE-eFluor ® 610
Ki-67 mRNA Alexa Fluor
GrzB Pr otein PE-Cyanine7
GrzB Pr otein PE-Cyanine7
750
®
GrzB mRNA Alexa Fluor
CD8 PE-eFluor ® 610
Ki-67 Pr otein eFluor® 450
Ki-67 mRNA Alexa Fluor
®
Ki-67 Pr otein eFluor® 450
488
2-day Anti-CD3/CD28 stimulated:
CD8 PE-eFluor ® 610
CD8 PE-eFluor ® 610
GrzB mRNA Alexa Fluor
PrimeFlow RNA Assay
C57Bl/6 マウスの脾臓細胞を未刺激 ( 上段 ) または刺激 (2 日間、
Anti-Mouse CD3 及び CD28 Functional Grade Purified antibodies (cat. no. 16-0031 及び cat. no. 16-0281)) ( 下段）
し、
Protein Transport Inhibitor Cocktail (cat. no. 00-4980) 存在下で 3 時間培養後、
PrimeFlow RNA Assay (cat. no. 88-18001) を使用し、
解析まで行いました。PrimeFlow RNA Assay キッ
トのバッファーを使用し、細胞の固定・膜透過処理を行った後、Anti-Mouse CD8a PE-eFluorR 610 (cat. no. 61-0081)、Anti-Mouse Ki-67 eFluorR 450 (cat. no. 48-5698)、AntiMouse Granzyme B PE-Cyanine7 (cat. no. 25-8898) で細胞内染色しました。その後、Type 6 Mouse Granzyme B Alexa FluorR 750 (cat. no. VB6-16522)、Type 4 Mouse Ki-67
Alexa FluorR488 (cat. no. VB4-16518)、Type 1 Mouse β -actin Alexa FluorR 647 (cat. no. VB1-10350) プローブをハイブリしました。
利用可能な抗体が制限される場合、mRNA 発現で解析ができます
フローサイトメトリーは、複数の測定項目を数百万の細胞で観察でき、また 1 細胞あたり細胞表面及び細胞内タン
パク質の両方を直接検出できるヘテロな細胞集団研究の為のゴールドスタンダードです。しかしながら、歴史的に
フローサイトメトリーは、測定項目への抗体の有用性、適応性による制限がありました。ノンコーディング RNA、
ウイルスの転写物、ユニークなモデル生物等のターゲットや抗体開発が困難なターゲットは、フローサイトメリー
を利用できず、細胞サブセットに対する影響を解析する為に核酸・タンパク質等多くの別々の実験が必要でした。
フローサイトメトリー用の抗体が存在しない場合でも PrimeFlow　RNA は特異的なターゲットの RNA を検出する
ことにより、フローサイトメトリーでターゲットの遺伝子発現を検出することができます。
PrimeFlow RNA Assay の感度及び特異性
PrimeFlow RNA Assay の感度評価を、同社 Affymetrix/Panomics のマルチプレックスのアッセイ試薬 QuantiGene
Plex Assay と行いました。Fugure1A に示されるように、すべての細胞タイプの中で U937 細胞中の GAPDH が、
最も高い蛍光値を示し、QuantiGene Plex assay の結果と一致しました。同様に U937 細胞で HMBS が最も低い蛍
光値を示し、QuantiGene Plex assay の結果と一致しました。S/N 比は、No Probe をコントロールとし算出しまし
た (Fugure1B)。
次に正常ヒトリンパ球及び単球において同じ遺伝子の発現を評価しました (Fugure1C)。U937 細胞は単球系細胞株
ですが、プライマリーの単球と U937 細胞の間で顕著な違いがありました。
HMBS は、完全にヒトプライマリーの単球で検出できませんでしたが、GAPDH, B2M は単球で最も高い発現を示し
ました。ヒトプライマリーのリンパ球ではさらに GAPDH が低く、B2M は高レベルでした。これらのデータは、遺
伝子発現が同じプライマリーセルタイプ由来の細胞株でさえ変化することから、興味のある細胞における遺伝子発
現レベルの理解が重要であることを強く示しています。さらに、QuantiGene Plex のデータに基づくと U937 細胞
での HMBS の mRNA 発現は 5-10 コピーであることが知られており、PrimeFlowRNA Assay は 5-10 コピー程度か
らの遺伝子発現を検出することができる十分に最適化されたシステムであることが示唆されます。
Figure 1B
Figure 1AU937
PPIB
GAPDH
Count
Count
B2M
B2M
PPIB
No Probe
GAPDH
HMBS
No ProbeB2M
HMBS PPIB
B2M
GAPDH
PPIB
GAPDH
140.00
140.00
Alexa Fluor ® 647
Alexa Fluor ® 647
Figure 1C
Lymphocytes
Monocytes
Alexa Fluor ® 647
Alexa Fluor ® 647
Count
Monocytes
Count
Count
Count
Lymphocytes
100.00
80.00
80.00
60.00
60.00
40.00
40.00
20.00
0
No Probe
dapB
No ProbeHMBS
dapB
B2M
HMBS PPIB
B2M
GAPDH
PPIB
GAPDH
Alexa Fluor ® 647
Alexa Fluor ® 647
100.00
20.00
122.4
120.00
120.00
Signal-to-noise ratio
HMBS
No probe
HMBS
Signal-to-noise ratio
U937
No probe
1.00
No Probe
122.4
68.9
56.1
68.9
56.1
1.0
3.6
No Probe
HMBS
3.6
HMBS
B2M
B2M
PPIB
PPIB
GAPDH
GAPDH
QuantiGene Plex と PrimeFlow RNA の
直行性のバリデーション
U937 細 胞 (Figure 1A, 1B) 又 は、 正 常 ヒ ト 末 梢 血 (Figure 1C) を、
PrimeFlow RNA Assay のプロトコルに従い、各遺伝子について Type
1 Positive Control Alexa Fluor 647 のプローブを使用しハイブリしま
した。S/N 比はポジティブコントロール遺伝子の MFI と No Probe の
コントロールの MFI の比から算出しました。
高い特異性
bDNA テクノロジーは、オリゴヌクレオチドペアーを使用し高い特異性を実現します。2 つのターゲットオリゴヌ
クレオチド（左のオリゴヌクレオチド及び右のヌクレオチド）が隣り合ってターゲットの遺伝子に特異的に結合し
た時だけ、シグナルが検出されるデザインになっています。アッセイの特異性を証明する為、左のオリゴヌクレオ
チド単独及び右のオリゴヌクレオチド単独のヒト GAPDH のプローブを、ヒトの U937 細胞で左右のオリゴヌクレ
オチドプローブと比較しました。蛍光シグナルは、プローブ検出され、U937 細胞での GAPDH の高発現と一致し
ました。対照的に、左のオリゴヌクレオチド単独及び右のオリゴヌクレオチド単独の場合、No Probe コントロール
と同様、シグナルは検出されませんでした。さらに、ネガティブコントロールプローブ（枯草菌由来のバクテリア
遺伝子 DapB）では特異的なシグナルは検出されませんでした。
Figure 3
Figure 4
Label Probe
Label
Probe
U937
800
Count
Amplifier
Amplifier
Pre-amplifier
Pre-Ampl ifi
GAPDH Left + Right
GAPDH Left Oligos Only
GAPDH Right Oligos Only
dapB
No Probe
600
400
200
RNA
RNA
Left Olig o
Left Oligo
0
10 0
RightOligo
Olig o
Right
10 1
10 2
10 3
10 4
Fluorescent signal
Figure 5
1200
1200
PrimeFlow RNA Assay の特異性の証明
MFI
MFI
1000
1000
800
800
左右のオリゴヌクレオチドペアー及びシグナル増幅試薬、Pre-
600
600
amplifier, Amplifier, Lable Probes を 含 む プ ロ ー ブ セ ッ ト デ ザ
400
400
イ ン の 図 (Figure 3)。U937 細 胞 に お け る GAPDH RNA 発 現 の
200
200
フローサイトメトリーヒストグラムのデータ (Figure 4). Mean
00
No Probe
Oligos Only
GAPDH Left
Oligos Only
GAPDH Right GAPDH Left
Oligos Only +Right Oligos
Fluorescent Intensity (MFI) をベースにした異なるプローブセッ
DapB
トでの GAPDH シグナルの定量値 (Figure 5)。
アッセイチャネルの感度
PrimeFlow RNA Assay は、3 つの異なる蛍光色素を使って、1 細胞中 3 つの異なるターゲットの RNA を検出する
ことができますが、各蛍光色素の感度は異なります。3 つの RNA 検出チャネルの相対的な感度を理解する為に、
U937 細胞中の同じ遺伝子の発現レベルを 3 つのプローブ Type で評価しました。Human B2M probe sets：Type 1
(Alexa Fluor 647), Type 4 (Alexa Fluor 488), Type 6 (Alexa Fluor 750) がヒト U937 細胞中の B2M RNA ターゲッ
トを検出するのに使用しました（Figure6）
。No Probe コントロールと比較し S/N 比を算出し、Type 6 (Alexa Fluor
Human B2M mRNA relative sensitivity (%)
750) プローブへの相対的な感度を評価しました。Figure6、7
で示されるように、Type 1 (Alexa Fluor 647) は最
600%
58.1
も高い感度を示しました。この為、発現レベルが低い又は発現レベルが分からない遺伝子を検出する際は、Type
1
500%
400% Type 6 (Alexa Fluor 750) のプローブは同程度の感度で、
プローブを推奨しています。Type 4 (Alexa Fluor 488) 及び
300%
発現が中から高レベルの遺伝子の検出する際に、お薦めしています。マウス脾臓細胞における
beta-actin の発現を
200%
評価したとき同様の感度が見られました。マルチカラーのフローサイトメーターでの結果は、測定機能、検出器の
13.4
10.7
100%
感度、装置の設定及びコンペンセーションに依存し、最善の結果を得るためには、それらを最適化する必要があり
ます。
600%
Type 1
AF647
Type 4
AF488
Type 6
AF750
AF=Alexa Fluor®
Figure 7
58.1
500%
Alexa Fluor® 647
Alexa Fluor® 488
Alexa Fluor® 750
300%
200%
13.4
100%
Count
Count
400%
Count
Human B2M mRNA relative sensitivity (%)
Figure 6
0%
10.7
0%
Type 1
AF647
Type 4
AF488
Type 6
AF750
ACTB mRNA
AF=Alexa Fluor®
アッセイチャンネルの感度評価
各チャネルの感度を評価する為に、U937
Type のAlexa
B2MFluor
プローブをハイブリしました。各バー上の数値は
S/N 比を示し、解析には総生
®
Alexa Fluor® 647
Alexa細胞に対して、各
Fluor® 488
750
Count
Count
総生細胞を使用しました (Figure 7)。
ACTB mRNA
Count
細胞を使用しました (Figure 6)。マウス脾臓細胞に対して、各 Type の beta-Actin (Actb) プローブをハイブリしました。アッセイは 3 回行い、解析には