1. No category

Kekkaku Vol.82,No 10:741-748,2007
74/
jZZタイピングにおけるVariable Numbers
ε
′
θ
rJz“αソ
bα
″κθ
とResmction Fragment Length
of Tandem Repeats(VNTR)法
Polymorphism(RFLP)法 の 有用性 の 比 較
祐子
l 菅原
勇
5 常松
範子
I 字 田川
2奥 村
忠
昌夫
1前 田
3東
司 桂
伸 由
1 鹿住
1村瀬 良朗
4後藤美江子
′″タイビ ングにおける Ⅵ爛Rと RFLPの 有用性 を比較す る。 〔
対象 および方法〕
要 旨 :〔目的〕″ αッ
“
(55株
(29株
・
)と HIV・血液か ら分離 された 12例
)を 用 い,西 森 らの
喀痰 気管支洗浄液分離 の36例
5を用 いた RFLPを 行 った。 〔
ν
J“
″用 VN『Rと IS 12イ
″α
結果〕16例か ら複数回採取 された検体は 12例
r“ε 滅″ の複合感染 (1
が VNTRと RFLPが 一 致 した。1例 (8株 )に 多 クロー ン感染 (2株 )と ′ jれ
`J′
株)が 認 め られ,VNTRは 2種 類であったが,RFLPは 5種 類確認 された。そ して HIV感 染者血液 の
1例 (6株 )の Ⅵ呵Rは 6株 とも同 じパ ター ンで あ ったが ,RFLPは 3パ ター ン得 られた。用 いた 84
染者血
株 の うち多 クロー ン感染が 6株 あ り,そ れ らは喀痰 ・気管支洗浄液か ら5株 (13.9%),IIIV感
′″と共 に他 の 菌種 の 複合 感染が 3例 (6.3%)あつた。
液か ら 1株 (8.3%)であ つた。 そ して M αν
“
Rが 一致 した例が ,全 48例 89株中で 4組 9例 (18.8%)あつ
VN￢
Rに お いて,接 触歴 のない株で VN「
J“
″分析例では RFLPの
たが,こ れ らの株 は RFLPで 区別可能 であった。 〔
結論〕今 回の84株の Z αν
分析能は Ⅵ爛限 よ り高かったが ,同 一例か ら採取 した検体か らⅥⅦRは 同 じであったが RFLPパ ター
ンが異なるものがあ り,1症 例か ら複数回の検体採取 を行 う必要性 が示唆 された。
),Resdction Fragment
キ ー ワ ー ズ : ″ァ οb a C たガン″ αップ , V 誼 a b l e N u m b e r s o f T a n d c m R c p c a t s ( W m 法
““
Length Polymorphism(RFLP法
) , 多 ク ロー ン感 染
は じめ に
プ″症 報 告 は多
卜だ け で な く,他 の 動 物 に お け る Mα ッ
“
つ
く,佐 藤 らの報告 で もブ タに病 原性 が認 め られて い る。
この ″ ανJ′
″の タ イ ビ ン グは血清 型 別 が 用 い られ て
J′
″は 1901年 に Chesterに よって トリ
αεた″
′″ αν
″″ο♭
“
の
る抗
に病 原性 あ
酸 菌 と して報 告 され 1 ) , 近年 , Ⅲ V 感
きたが ,特 殊 な機材 と技術 的熟練性 を要す るため ,現 在
染者 に播種性 感染 を引 き起 こす こ とで注 目されて い る。
で は挿入配列 (Insenion sequence:IS)型
別 に よるタイ ビ
′
′″″ c o m p l e x
r “ε′
日本 にお け る″r ο♭αC r ` ガ″ αν′π J ″
“
“
“
( 通称 N I A C : マ ック) は 疫 学 に地域 的分布 差 幼が あ り,
ングが広 く行 わ れ て い る。 この 方法 は Is9ω,ISI」J′な
近 畿以東 の北海道 ・東北 ・関東 ・東海 お よび近畿 では M
ανιれ, 以 西 で あ る中国 ・四国 。九州 で は M j ″ ″ε ′ ″
`′
“
“` α
が比 較 的多 い。 そ して この 菌種 は非病 原性 菌 と して 自然
界 に も多 く存 在 し, 斉 藤 ら" は 2 4 時 間風 呂 にお い て ν
J′
れが 浴水 で は少 なか った もの の , フ イル ター や濾材
αッ
か ら高率 に検 出 された と報告 して い る。 さ らに トリや ヒ
1結核予防会結核研究所抗酸菌 レファレンスセ ンター,2結 核予
防会複十字病院呼吸器科,3同 検査課,4東 京大学医学部附属病
院感染制御部微生物検査,5東 京都立大塚病院検査科
い て 制 限 酵 素 断 片 長 多 型 Rest五
ction Frttpe
'を 用
の 研 究 が 行 わ れ て きた
Length Polymorphism(RFLP)法
5が 発 見 され 0,
が ,現 在 は 1414 bpの長 さ を もつ ISf2イ
ど
これが広 くRFLPに 用 い られるようになった。そ して近
年,結 核菌のタイビングに使われているVmable Numbers
′″において も応
of Tandem Repeats(｀
いぽR)法 つが ″ αν
“
J“
″タイビングに
ν
用 されつつ あ り,今 回われわれは M α
連絡先 :鹿 住祐子,結 核予防会結核研究所抗酸菌 レファレンス
-24
セ ンター病理検査科 ,〒 204-8533東 京都清瀬市松 山3-1‐
(E―
p)
maill [email protected]」
(Received 14 Jun 2∞
7/Accepted 25 Ju1 2007)
結核 第8 2 巻 第 1 0 号2 0 0 7 年1 0 月
74_2
D N A を 切 断 した。 電気 泳動 は0 8 % ア ガ ロー ス を用 い ,
お け る やヽTRと RFLPの 有 用 性 を比 較 した。
22 mA・
3 0 V で 1 6 時間行 った。 そ して ア ル カ リ変性 させ ,
材 料 と方 法
DNAを
(1)材 料
1 本 鎖 に し, トラ ンス メ ンブ ラ ンフ ィル ター に
6 時 間転 写後 U V 固 定 を行 った。 さ らに ビオチ ン標 識 プ
あsJs H37Rv,
被 検株 として主 な抗酸 菌 21菌 種 (M′ レ rc“
“
ルをたαれsasJ′
: ATCC12478, lVf′″αrれι
`772: ATCC927, M
gα′: ATCC35799, ″
ι
ι
ι
ι
sε
漁
″ : ATCC19981, ルイsぇ
勾 c`ι
`α
gοだοれα
イαソ
Jι
ι
″2 subsp αッ
」
ι
J12: ATCC
ル
ι
`: ATCC14470,
ν′
ι
′
25291, /Vrι
ι
ι
ι
a subsp
οsお: ATCC19698,
′α ″ わ ι
“ “ `κ
ι
1イανJι
sι
Js" :ATCC19978, l1/fαソJι
″π subsp
`777 SubSp.“
れr′
ι
′
42c`′
′
ι
α :ATCC13950,
s〃ソ
α″c“れ:ATCC49884, 1イ 」
“
2ε
力″
れicι
ι
ル
イgαsrr′
: ATCC15754, `′ れο′
ο7720gθ
″ : ATCC
1 9 5 3 0 , ノ ′ ′: A T C C 1 5 7 5 5 , ン ブb ″ ル 凛 : A T C C 6 8 4 1 ,
`″
“
““
力 πα
ι
ルι
ι
鷹:ATCC 49403, :1/rcん ′′
。れαιsubsp σ
ンフ
の″ι
`Jο `:
″
2ι
ATCC35752,ル 4αわ∫
ει
ssι
ι
S:ATCC19977,Jビ
ι
εο.● Jε″:
`れ “
r`れ
ι:
ATCC49650,
ν′
′
4′
∫
′αν 712:ATCC51985, ルr“αg`″′
“
οε
夕s ` クι
ι
」: A T C C
A T C C 7 0 0 3 5 1 ) と抗 酸 菌 に近縁 の R 力οあ c ο
6939,,Vο
cα
″′
ααs た″J あ: A T C C 1 9 2 4 7 を 加 え た 計 2 3 菌 種
と 1 6 S r R N A シ ー ク エ ン ス3 ) によ っ て ン αν′″ と 同 定 し
“
た A か ら D の 医療 施 設 ・4 8 例 か らの分 離 8 4 株 を用 い た。
この 内 訳 は 1 6 例 か ら複 数 回 臨 床 材 料 を採 取 して得 られ
た 5 2 株 , 1 人 1 回 の 検 体 採 取 が 3 2 例 3 2 株 で あ っ た。 対
象 と な っ た 症 例 は 病 院 の 入 院 患 者 ( 肺癌 , H I V な
ど) ,
ロー プ D N A ; I S ノ2 イ
5 " 1 1 ) を加 えたハ イプ リダイゼー シ ヨ
ン液 にてハ イブ リダイゼ ー シ ョンを行 った。次 にペ ルオ
キ シ ダー ゼ 標 識 ス トレプ トア ビ ジ ン ( R o c h e 社) を 反応
させ , ア ル カ リ下 で E C L ( G E ヘ ル ス ケ アバ イ オサ イエ
ンス) に て化 学発光 後 に X 線 フ イルム に感 光 させ て現 像
した。
結
果
( 1 ) 主 な抗 酸 菌 2 1 菌 種 と近 縁 2 菌 種 に よる V N T R と
RFLPの 結果
主 な抗 酸 菌 2 1 菌 種 と近縁 2 菌 種 の V N 「R の 結 果 は2 3
菌種 す べ て に 1 か ら 1 6 の M A T R に お い て複 数 力所 にバ
ン ドの形 成 が み られ た。F i g l は西森 らの ν ανJ “
″用 の
′
″れ
プ ライマー M A T R を 用 い て P C R し 電気泳動 した ″ αν
′
οsJs H37Rv
subsp αッ
ピ″:ATCC 25291(A)
とハ
イ′
ン♭ ι
`rcι
“
(
M
α
( B ) で あ る。4 種 類 の ″ αν
ッι
ン″ s u b s p .,α
“″,
J“
″
ッ′
ン″ subsp “
,s",
鉦,α
ν′
滋″ subsP ′αrα
′
ι
イ
.α
s“
め′κンピ
οsJs, ハ
:“
″s u b s p ′
ピ
ν αν
sν
′
α′
ο ) は 1 か ら1 6 のM A T R す べ てに
“
“
バ ン ドの形成が み られた。一方, 他 の菌種 はバ ン ドの な
あ る い は外 来 患 者 ( 呼吸 器 疾 患 , リ ウ マ チ な ど) で , M
い MAηRが 複数 あ った。MATR‐ 0(Fig l右 端)に おいて
″症 の 有 無 は確 認 して い な い 。
ανJ “
バ ン ドがみ られたのは ν ′α ′
ンbarcン
′
οsJsのみであ った。
“
RFLPで は ,4種 類 の ν αッブれ以外 か らバ ン ドの形 成
“
はみ られ なか った。
(2)DNAの
抽出
2 週 間培 養 した M i d d l c b r o o k 7 H 9 液
体培 地 発 育 菌 2 5 m ′
を4,200 rpm 15分
間 遠 心 沈 殿 し, 沈 査 を I S O P L A N T ( ニ
(2)16例
ッポ ン ・ジー ン) の マ ニ ュ ア ル に従 っ て抽 出 を行 い , ‐
に よる検討
( p H 8 0 ) 2 0 0 μ ′に浮 遊 させ D N A 抽 出液 と した。
16例 か ら複数 回採 取 した臨床材 料 か ら分 離 され た ″
αッ
′″ 52株 につ い て VN「Rと RFLPを 行 った (Tablc l)。
“
症 例 番 号 1か ら H,16は 検 体 の種 類 が喀 痰 あ る い は気
(3)V螺
P C R の 温 度 条 件 とサ イ ク ル 数 は西 森 らの 方 法
従っ
"に
て 17種 類 の プ ラ イ マ ー セ ッ ト (MATR)を
使 用 した。
b o r a t e (田
´E ) , 2 . 5 % ア ガ ロ ー ス ゲ ル
P C R 産 物 を 1 ×T 五s ―
か ら複 数 回採取 した臨床材 料分離 の ″ ανJ“
“
管支洗浄液,12か ら15は HIV感 染者 の血 液であ る。
(a)症例番号 1,2,3,4,5,6,8,H,13,14,15
と
に て サ イ ズ マ ー カー ( 1 0 0 b p D N A L a d d e r M a r k e r )共
で は Ⅵ爛Rと RFLPが それぞれ の症例 内 で 同 じパ ター ン
に 電 気 泳 動 した。 泳 動 後 サ イズ マ ー カー よ り増 幅 産 物 の
と な り, 症 例 番 号 9 の K K 4 1 ‐3 7 7 と K K 4 1 ‐3 7 8 は V N Ж
バ ン ドのサ イズ を簡 易 的 に計 測 して , 西 森 らの換 算 表 に
が 同 じで あ ったが , R F L P は
従 って 反 復 配列 の コ ピー 数 を求 め , ア リル プ ロ フ ァイ ル
1 本 バ ン ド違 い であ った。
( b ) 症 例 番 号 7 で は 2 0 0 3 年 3 月 か ら2 ∞4 年 1 月 まで
を作 成 した。
の 間 に 8 回 検体 が 採 取 され , 6 回 は喀 痰 , 2 回 が気 管 支
この とき,各 MATRで 複 数 の バ ン ドがみ られ た とき,
J“
Mα ソ
″が複 数混在 (以下 ,多 ク ロー ン感染),ま た他 の
洗 浄液 で あ った。検体 番号 Ю0 1 - 3 6 6 は V N T R に て 3 カ
菌種 の 混入 を疑 い,7H9液 体培 地発 育 菌 を lo6まで希釈
し,そ の 0.1■
1プ
を7H10寒 天培 地 に接 種 .培 養 し,シ ン
グル コロニー を得 てか ら再 分析 した。
(4)RFLP5)10)11)
RFLPは Soolingcn"らの 方法 に従 って実施 した。DNA
抽 出液 を エ タノー ル沈 殿 後 ,制 限酵 素 Pν Ⅱに よ って
“
所 ( M A T R 3 ・ 4 ・1 2 ) に ダブルバ ン ドがみ られ , コ ロニ ー
を シ ングル化 した後 , そ れ ぞれ の コ ロニー を 1 6 S r R I N A
法 に よって 同定 した結 果, ″ αν′″ と″ J ″″εα′″″の
“
“
複 合感染 で あ つた。 この シングル コロニー か ら得 られ た
″ αヵ″れを液体培 地で増菌培養 し, 再 度 , V M R を
行 い,
そ して R F L P を 行 っ た。K K 4 1 - 3 6 8 ( 気 管 支 洗 浄 液 ) は
V ヽT R の M A T R 番 号 3 と 4 に 2 本 バ ン ドが み られ, 寒
V疎
&RFLP in′
αソ減″ Typing/Y Kazumiet al.
743
Fig。1 (A)VNTR analysis Pattem ofン
ανル″ subsp αソル腕 (ATCC25291)(B)VNTR pattcm of
″ ″ι
わsお (H37Rv).
`κ
The p●mcr“sets reported PrcviOusly9'werc used._M:100 bp ladder markcr;l to 16 were scquentially in
number oflocus in NishilnoH'sp五rncrsets O was used fOr跛_αソ:ι
″η subsp ′α´
αんι
わ ει
ι
ノ
οsJs ditection.
`“
Table l
恥螂
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8
9.
10.
11.
12
13.
14
15.
16
Companson of V卜 日『
R and ISf2イ5 RFLP analyses in the cases that specimens
were collected from idendcal patients several time.(16 cases,52 strains)
S面S
KK41-300,300-1
KK41-347,348
KK41-352,353,354,396
KK41‐ 355,356
KK41‐ 357,358,359
X[I(41-360,361
KK41-366-373
KK41-375,376
KK41-377,378
KK41-379,380
KK41-392,393,394
スコく41‐398∼ 403
ml‐ 404-406
KK41-411∼
413
K K 4 1 ‐4 1 5 ∼ 4 2 0
KK41-438,440
ttiだ
2
2
4
2
3
2
8
2
2
2
3
6
3
3
6
2
Results oF VNTR
Same
Sarne
Same
Same
Results of RFLP
same
same
same
sarne
Same
same
Same
same
Polyclone and supeHnfection Difference
of the other』
インεο♭αε′
′′
′
α
Same
Same
Same
One band dirercnce
Same
DifFerencc
Sme
Same
Same
Same
Same
Same
SupeHnfection ofthe other
ルケεοιac″″α
Differcnce
Same
Same
Samc
Same
天培 地 で シ ン グル コ ロニ ー を作 り, 再 度 V N 『R に て確
と 5)と な ったが ,KK41-371は 増 菌 で きなか ったため最
認 した ところ, 2 種 類 の ″ αッ
J“
れが 混在 した多 ク ロー ン
終 的 に 8株 を検査 し,vblTRは
感 染 で あ っ た。K K 4 1 ‐3 7 1 は 分 譲 され た 元 株 ( 小り
￨ 1 培地
ンであったが, R F L P は①から⑤の5 種類あった ( T a b l c
発 育菌) に て行 った V M R で
多 ク ロー ン感染が確認 され
たが液体培養で発育せず, 死 菌 と考えられた。 このため
Aと Bの 2種 類 の パ ター
2)。
(c)症 例 番 号 10の 2株 は vNTRが
同 じであ ったが RFLP
分析 に必 要 なD N A 量 が得 られず, R F L P は 実施 で きな
か った。 この 8 検 体 の結果 は V N R に お いて多 ク ロー
は異 なった。
( d ) 症例番号 1 2 は1 人 の H l v 感染 者か ら採取 された
ン感染 で あったため K K 4 1 ‐
3 6 8 は2 つ ( コロニ ー番 号 1
血 液 で 1 9 9 8 年l o 月か ら1 9 9 9 年3 月 まで の 間 6 回 採取
結核 第 82巻 第 10号 2007年 10月
アイイ
Table 2
Typing Pattem of isolates frolll case 7
Number of strain
KK41-366
KK41‐ 367
KK41-368(1)
KK41-368(5)
ま、ανJ“
″ Pattem´ゝandルriれ αc`′
ノ
ク′
α´
ι
`″
Pattcm A
pattcm A
KK41-369
KK41-370
KK41-371
KK41-372
KK41-373
pattcrn 2ヽ
Fig.2
pattcm B
pattem A
Polvclonc
pattern A
Pattcm A
pattem①
paucm②
panemO
pa■
em④
pattemЭ
pattemO
Non
pattem3
paにmO
RFLP pattem of織 _αν′
ンa isolatcd ionl blood spccilnens of IIIV patient
M Lambda″ れグⅡI digested DNA markc■1:KK41-398(lst sample),2:KK41-399
(4 months laters),3:KK41-400,4:KK41‐401,5:KK41-402,6:KK41-403
し,VN￢ Rは 6株 と も同 じで あ った が ,RFLPパ
ター ン
は K K 4 1 - 3 9 8 ( 採 取 時 期 1 9 9 8 年1 0 月2 6 日 株 ) と
KK41-399(1999年
2月 19日 株 )は そ れ ぞ れ別 パ ター ン
で あ った。 さ らに これ ら 2株 は 同 一 パ タ ー ンで あ った
KK41-400(1999年
2月 20日 株 ),KK41‐ 401(1999年
3
月 1日 株),KK41‐ 402(1999年
3月 10日 株 ),KK41‐ 403
(1999年 3月 17日 株 )と 異 な った。 従 って症 例 12の 6株
か ら VN￢ Rは 1種 類 で あ ったが ,RFLPパ
ター ンは 3種
類得 られた (Fig_2)。
KK41-398, KK41-399と
′″ と同定 し, 9 個 が M
定 した。 そ の結 果, 1 個 を ν αソ
“
J″
r ″ε ′
クた″で あ った。 これ に よ っ て 得 た ν αガ ″ ( 新
`′
“
た な KK41-438)を 2004年 に 同 じ症 例 か ら分 離 し た
KK41‐440と 比 較 した。 この KK41‐ 0の VNTRは そ れ
“ ドで ,複 合感 染 は
ぞ れ の MATRに お い て シ ン グ ル バ ン
な く,両 者 を比較 した結 果 ,VNTRと
RFLPの 結 果 は同
じであ った。
(3)他 の菌種 との 複合感染 と ″ α,′″の 多 ク ロー ン感
染
KK41 400の 比較 を Fig.2に示
(a)″ αソ
J“
″ と他 菌種 の複合 感染
3 9 9 を比 較 す る と K K 4 1 - 3 9 8 の①
す。K K 4 1 - 3 9 8 とK K 4 1 ‐
48例 84株 の うち 1株 (HIV感 染者 ・血 液)か ら VNTR
と②がKK41-399で
は消失し,③ と④が出現した。この
KK41-399と
K K41-400を
比較した結果,④が消失し,①
が出現した。
J“
れ と共 に検 出 され た。
に よって ン ′レκ sおが ν αッ
“ “`ο
Fig 3(A)は 分 離 株 の VN取 の 結 果 で あ り,複 数 の
(e)症例番号 16の 2検 体 の うち KK41-438(2006年 1月
採 取 )は 複 数 の MATRに
複 数 の バ ン ドが み られ た ため
寒 天培 地で シ ン グル化 し,そ の 中 の 10個の シ ング ル コ
ロニ ー を と り,そ れぞれ 16S rRNAシ ー クエ ンス にて 同
MATRに 複 数 のバ ン ドがみ られた。 この ときの ア ンプ リ
コアマ イ コバ クテ リウム (Rochc社)い の結果 は ″ ′ιιル
“
ι
″ 共 に陽 性 で あ っ た。 この た め
αν′
ε sJs complex,″
“`ο
′
ンε′
OSおの 混在 を考 え,寒 天培 地 にて
め′
ν αッ′れ と ″ ′
“
“
単 一 菌 種 の コ ロ ニ ー 化 を試 み た が ,″ ′b`κ″′
οsJ5と
“
VllTR&RFLP in 14
j“
″Typing/Y Kazumietal
αッ
7イ
∫
L″ι
′
οs:s and iこανJン )
ヽTTR pattem of KK41-408(a combhed case of“
Fig.3
`κ“
“
bθκ あsお were detected by the Amplicore klt.
This was a double infection case(A)ル こαッル″ andルこんι
“
So,bacilll were cultivated with INHお r2wccks at 37℃ .In analysis of Amplicore kit,Ⅳ『B bccame
ncgat市e andル4 αν′″ was positive.VNTR analysis was perforrned again(B).
“
Jン
れのそれぞれ独 立 した コロニー を得 る こ とが で き
″ αッ
なか った。 この ため これ を M G I T ( ベ ク トンデ イ ッキ ン
Table 3 The groups ofthe strdns with identical
VNTR pronle and drfcrent RFLP pattem
Group 2
KK41‐ 346
KK41‐ 430
′
α″の複 合 感
れ と Z 赫 ″ε
αJ ′
J“
2 株 ( 喀痰 由来 ) が M α ソ
Group 3
染 で ,こ の M′ンタ わsisと合 わ せ て 他 の 抗 酸 菌 が
`κ“
Mα ソ れ と共 に検 出 され たの は48例 84株 中 3株 (6.3%)
`′
であ った。
KK41-255
KK41‐ 271
Group 4
KK41‐ 431
X3く41‐434
″陽性 を確 認 し,
い , M ′ b ` r c′
οs i s c o m p l e x性
陰, M α ッJ “
“
“
Fig 3(B):写 真
v M R を 実施 し″ αッ′ の結果 と した 〔
“
“
は左 か ら 1 ∼ 1 6 の M だ R を 使 用 した結果 であ る〕。他 に
Hospital
Ｄ Ｄ
KK41‐ 254
KK41‐ 345
KK41‐354
Ａ Ａ
し, 培 養後 に再度 ア ンプ リコアマ イ コバ クテ リウム を行
Group l
Ｂ Ｄ
Number of Group
Ａ Ｂ Ｃ
Stralns
ソ ン社 ) ・0 . lμg / m ′I N H 含 有 液体 培 地 に て 2 週 間培 養
(b)多 ク ロー ン感染 の株
48例 84株 か ら Mα ッ′れの 多 ク ロー ン感 染 で あ っ た 6
“
よって 検 出 され た。 この 内訳 は喀痰 と気
株 が VNRに
点が認 め られ なか った。
管 支鏡 洗 浄 液 の 36例 (55株)の 中 に 5株 (13.9%),W
感 染者 血 液 12例 (29株)の 中 に 1株 (83%)の み で あ っ
(b)この他 に施設 A(KK41‐272‐
2)と施設 C(KK41‐375)
は VhlTRの パ ター ンが 同 じで ,RFLPの 結 果 はバ ン ドの
た。
位 置 が 一 致 して い た もの の KK41-272-2が5本 バ ン ド,
KK41-375は 4本 バ ン ドで バ ン ドが 1本 異 な るパ ター ン
(4)VNRの
結果 を RFLPと 比較
84株 に加 えて多 ク ロー ン感 染 の た め シ ン グル化 し,
新 た に 6株 が 追加 とな っ たが ,KK41‐ 371が対 象 か ら削
除 され,計 89株 の比 較 を行 った。
(a)48例 (89株)の VblTRの 結 果 を RFLPと 比較 した。
VllTRが 同 じパ ター ンを示 し,RFLPが 異 なった 4組 (9
例)を Tabに3に 示 した。 グルー プ 1,2は 異 な った施設
の例 で ,3と 4は 同 じ施設 で あ った。 同 じ施設 内 の例 は
診療期 間 に違 いが あ るな ど,こ れ ら4組 にはそれぞ れ接
で あ った。
(5)RFLPの
バ ン ド数 につ い て
RFLPを 行 った 89株 の う ち 17株 (19.1%)はバ ン ド数
が 3本 以下 で あ った。
考
察
結核 菌 の RFLPは 結核 感染 の疫学調査 や集 団感染 ,あ
る い は小 さなグ ルー プ (同 じ事業所 内 ・病 院内 ・家 族 内
イσ
ア
結核 第 8 2 巻 第 1 0 号 2 0 0 7 年1 0 月
ロ フ ァ イ ル で 単 ク ロ ー ン感 染 で あ る と考 え られ た が ,
感染 な ど) に お け る感染拡大予 防の ため に導入 され , さ
らに この 感染経路解 明 1 0 だけで な く, 検 査技術 の 高度化
R F L P 分 析 に お い て 3 種 類 の パ タ ー ンが 得 られ た ( R g
に よる検査室 内汚染 1 つ
の原 因追求 の ため に も用 い られて
2 ) 。 この 変 化 が ヒ トの体 内 で す で に起 こ っ て い た の か ,
い る。 結核 菌 型 別 には I s 6 〃θを使 った R F L P が 使 われ,
菌株 の 保 存 条件 が 原 因 した の か , 継 代 培 養 も含 め て 実験
ν αν
′れの型別 には I S ′
2イ
5 が 用 い られ て い る。 しか し,
“
И α, ` 〃 は 自然界 に も多 く存在 し, 分 裂時 間 。発 育温度
“
域 ・環境 に適応 す る能力が 結核 と異 な り, ま た ヒ トの体
中 に生 じた の か 不 明 で あ る。 症 例 7 と 1 2 は V N T R が 同
わ っ た。 こ れ は Ⅵ刈R に お け る コ ピ ー 数 の 変 化 よ り,
内におけ る多 ク ロー ン感染 や他 の菌種 との複合 感染 な ど
RFLP分 析 に お け る Is′
2 イ5 の 変 化 の ほ う が 生 じや す い
の頻度 も高 く, この研 究 を困難 に して い る。 同一 症例か
らはほ とん どの場合 , 同 じV N T R ・Ш■P パ ター ンで あ っ
ν αソ′れが あ る こ とを示 唆 して い るc
“
V たd m a ら 2 0 は結核 菌 にお い て M I R U ―V N T R と
たが, T a b に 1 の症 例 番 号 7 の よ うに, 同 一 症 例 か ら多
比較 し, Ⅵ ⅥR は 同時 に 2 種 類 の 結 核 菌 を検 出 で き, 有
ク ロー ン と ν αν
J“
″, M 」 ″ ε ′/ 4 “の 複合 感染 が 確 認
“ `ノ
“
され るな ど判定 の 困難 な症例 もあ る。′ αソ
′れは通 常 一
“
の
過性 で , 1 人
症例 か ら 1 回 検 出 され るだけの ケ ー ス が
用 性 が 高 い と報 告 した。 l V rαν
ι″ に お い て も R F L P で は
“
多 ク ロー ン感 染 を見 つ け るた め に は 数 多 くの コ ロニ ー を
検 査 しな け れ ば な ら な い が , V N T R で
多 いが , 症 例 7 は 基礎疾患 に リウマ チが あ り, 免 疫 と ′
ン ドが 複 数 で き, そ の 存 在 を容 易 に 見 つ け る こ とが で き
″●
ルれの 多 ク ロー ン感染 ・他 の 菌種 との 複 合 感染 の 関連
4 例 は多 ク ロー ン感染 や他 の 菌種 の混 在, そ して V N T R
る。 そ れ だ け で な く, И αソた 以 外 の 抗 酸 菌 は I s ′
2イ
5を
“
もた な い た め I S ′
2 イ5 R F L P 分 析 を適 応 す る こ とはで きな
0
,
ν
いが
αソ 用 の V N 「R を 用 い た場 合 , 他 の 抗 酸 菌
“
`“
だ け で な く, R 力 οあ c ο
/ο
εε s s p や ハ
c ″′α s p も 検 出 す る
“
こ とが で き, 他 の 菌種 が 複 合 感 染 して い る場 合 も簡単 に
と R F L P の 結 果が くい違 うな ど, 同 じ症例 で も, 常 に同
見 つ け る こ とが で きる とい う利 点が あ る。 この ため
じ結果 で はなか った。 このため家族 内同一感染 源が疑 わ
Ⅵ爛R を 行 うにあたってあ らか じめ ″ αν
:ク
れと同定 され
れ る場合 , 必 要 に応 じて複 数 回の臨床材 料採取 が望 まれ
た株 を用 い る必要があるが, わ れわれは′ αν
″ の分析
“
において も同様に多 ク ロー ン感染 と, 他 の抗酸菌の同時
につ い て , 今 後 , 例 数 を増 や して検 討 したい 。
同一 症例か ら複 数 回臨床材料 を採取 した検 討 で は, 1 6
例 中 1 2 例に V N T R と R F L P に て同 じ結 果が得 られ たが ,
る。
H I V 症 例 の 報 告 で は P i c a r d e a uい
らは 9 3 例 か ら8 9
R F L P パ ター ン ( 9 5 7 % ) が 得 られ , フ ォ ロー ア ップ され
た3 9 例の うち3 7 例が単 ク ロー ン感染 ( m O n O c l o n d ),で
じに もか か わ らず 短 期 間 の 間 に R F L P の パ タ ー ン が 変
RFLPを
は各 MATRに
バ
ν
J“ 用 の MATRを 用 い た
検 出 にお い て西 森 らの ′ α
“
VNTRは 有用であると考えた。
2 株 は初めの R F L P パ ター ンと異 なった。今 回のわれわ
さらに RFLPに は,① PCRな どの核酸を増幅す る作業
が な いため菌量が微量 であ る場合,増 菌 (2∼ 3週 間)
れ の研 究 で もH I V 患 者 の 血液 の フ ォ ロー ア ップ 4 例
( T a b l e l症例
の 番 号 1 2 から1 5 ) の うち 1 例 ( 症例 番 号
を行 わなければならない,② DNA抽 出か ら判定 まで検
査過程が長 い,③ バ ン ド数 の少ない場合,別 の方法での
1 2 ) は R F L P が 初 め の パ タ ー ン と異 な っ た。 L a 五らl " の
報 告 で は 5 2 の H I V 陽 性 例 の う ち, 4 7 例 が 単 ク ロー ン感
確認が必要 となる,な どの問題があ る。 このバ ン ド数の
少ない株 については森山ら21)も
斑■Pに は IS′
2イ
5におい
染で,5例 が多 ク ロー ン感染 (polyclonal)で
あ った。そ
て単一バ ン ドがあったため RFLPの 菌株鑑別能が低かっ
して今 回 の われ われの 研 究 で もHIV感 染者 12例 1株
(83%)に 多 ク ロー ン感染があったのみで,血 液検体で
たと報告 して い る。結核菌 の RFLP法 にお いて,バ ン ド
数 (コ ピー 数)が 少 な い場合,タ イ ビング能力 が落 ち
る2oとぃゎれ,他 の方法で確認することが勧め られてい
は喀痰 などより単クロー ン感染が多 いと考えられた。
2イ
5に て ″ αν
:“
″の RFLP法 を行 った
桑原 ら101DはIs′
るが,″ αソ
J“
″の場合, トリ由来株 はバ ン ド数が少ない
とい う報 告 り もあ り (ATCC標 準 菌株 :И αν
′
″
″ subsp
場 合 ,1本 バ ン ドの 変異 は同一株 とみ な してお り,今 回 ,
われ われ もその ル ー ル に従 った。 そ して Bauerら18)は1
j“
αν
″:ATCC 25291は3本 バ ン ド),今 後,バ ン ド数 の
年 間 に 33回 液体培 地 に よる継 代培 養 を繰 り返 した とこ
少ない例の検討が必要 と思われる。
ろ,ν αッ
Jι
閉 6株 の うち 4株 に 1な い し2の バ ン ドが 変
今 後,①
VNTRの 感 度,② 検体が喀痰 であ る場合 ,
化 した と報 告 した。Pesに1-ctton 191は
ISゴ
2イ
5の 安 定 性 に
喀痰 の中の雑菌 を処理 し,均 一にする前処理 の生 菌数に
つ い て評 価 を行 うた め分離 菌 32株 を分 析 した。 そ の 結
(16%)で 3本 以 上 の
与える影響,③ 分離 された菌の保存方法 と継代培養 の及
ぼす影響,① プ レー トか ら採取す る コロニー数 の問題,
違 い が 認 め られ た と報 告 した。 われ わ れ の 行 った 今 回
⑤ VN『Rと RFLPの 結果が異な った場合の解釈 ,な どの
の HIV感 染者血 液 か ら分離 され た 斑く41-398から KK41-
課題が残 った。
果 ,8例
(25%)で 1∼ 2本 ,5例
403ま で の 6株 は ,VNTR分
析 に よって ,す べ て 同一 プ
なお,今 回の研 究 を通 じて,主 な抗酸菌 21菌種 と近
Vm&RFLP inに
αッ
:“
″T y p i n g / Y K a z u m i e t a l .
74ア
縁 の 2 菌 種 と臨 床 分 離 8 4 株 の M αν: “
れにお い て西 森 ら
の NIAR-0に
よ っ て P C R が 可 能 で あ っ た の は ″ ανル″
subsp.′
αr a r レ
ン κι
あ s i s : A T C C 1 9 6 9 8 のみ で あ っ た。 ク
ロー ン病 の 原 因 菌 で あ る M α ッ れ s u b s p . ′
α″r “
bι
κ ′
οs お
“
`“
は核 酸 の 塩 基 配 列 を解 析 す る 1 6 S r m J A 法 や ψοB 遺 伝 子
に よ っ て 他 の ″ α, “″ ( ″ αν
ブ″ s u b s p . α
νj “
″, M α ソ′″
“
“
subsp.“s“Js",ン αッJ′
″ subsp sJ′
″)か ら分 け る こ と
"ric“
が で き な い が め, 西 森 らの M ανl l ″用 Ⅵ 爛R ・ ンm T R - 0
1 ま″ αν: “
″ s u b s P ′α″r “
ノ
ι
ο壺 を これ らか ら簡 単 に分
`rc“
け る こ とが可 能 で あ る と考 え られ る。
ま
と
1995;33:304-307
Supply P,Mazars E,Lettcan S,Ct al:Varlabic human
面 nlsatellite-lke regions in theル
οsお
″CοιαCr`″ ″ ″ら′κ″′
“
genOme.NIIolecular Microbiology 2000;36:762-771
鹿 住 祐 子,前 田 伸 司,菅 原
結核 .2006;81:
551-558
西森
敬 ,内 田郁 夫,田 中
聖,他 :VNTR(Vanabに
N u m b e r o f T a n d e m R e p e a t s )別
型に よる結核 菌 群 お よび
鳥 型 結 核 菌 の 分 子 疫 学 的 解析 マ ニ ュ ア ル
動衛研研究
報告書 2003;109:25-32
″感 染 症 の 分 子 疫 学 の 新 た な
高 橋 光 良 : 結 核 と M a νj “
展開
め
勇 : ″οB 遺 伝 子 と 1 6 S
r R N A 解 析 に よ る抗 酸 菌 同 定 の 試 み
資 料 と展 望 2 0 0 4 1 5 1 : 5 7 - 7 0
11) Johansen TB,Djonne B,Jensenヽ /1R,et al:Dis“bution of
V N : R は , 迅 速 で あ り, 微 量 で 検 査 可 能 , 多 ク ロー ン
IS′Jff and ISノ2イ5 inル 多εοιαC″万″れ αッJι
ι
れ subspecies
感 染 と他 の 菌 種 の 混 在 を確 認 で き, R F L P で バ ン ド数 の
revisited Ctinレ
I icrobio1 2005:4312500-2502
少 な い株 の 確 認 方 法 と して使 え る な ど有 用性 が 高 い 。 し
阿 部 千 代 治 ,齋 藤 由 美 子 、本 山 禎 二 ,他 :ア ン プ リ コ
か し, V M R は
変 化 が R F L P よ り少 な く, V N T R で
は接
触 の な い 症 例 同士 が 同 じパ ター ン とな った例 が あ った。
こ の た め わ れ わ れ は Ⅵ 呵 R を 2 段 階 と考 え , ま ず 被 検
株 の 多 ク ロー ン感 染 と他 の 菌種 の 複 合 感 染 が な い こ とを
確 認 す る た め に V h i T R を 行 い , シ ン グ ル コ ロ ニ ー を確
アマ イ コバ クテ リウム キ ッ トの 評価 に 関す る共 同研 究
結核
1997;72:181-186
伊 藤 邦 彦 ,高 橋 光 良 ,吉 山
崇 ,他 :病 院 検 査 室 に お
け る結 核 菌 培 養 の Cross―
contamination結 核 .1999;74:
777-788.
14) Picardeau M, Varnerot A, Lecompte T, et al.:Use of
行 う。 そ して
different rnolccular typing techniques for bactedological
同 じパ ター ンが 出 た と きは R F L P を 行 い , 総 合 判 断 す る
follow‐
up in a clinical bial with AIDS patients with″
Cο―
ッ
♭acr`だ ″ ανJι
″π bacteremia J Clh Microbiol 1997;35:
“
2503-2510.
保 した 後 に再 度 , 解 析 の た め に V N R を
こ と に よ っ て よ り精 度 の 高 い 分 析 が で き る と 考 え られ
る。 また 1 症 例 か ら異 な っ た パ ター ンが 得 られ る可 能 性
を考 え, 複 数 回 の 臨 床 材 料 採 取 が 望 ま しい と 考 え られ
る。
Lan N,Cavallini M,Rindi L,et al:Typing of humanゴ Иッεο―
″
♭acrι
′
″ αν′
″ isolates in ltaly by 2イ
ISノ
5-based resmctiOn
“
“
frattnt length polymorphism analysis J Clin Microbiol
1998;36:3694-3697)
謝
辞
貴 重 な臨床 分 離株 を分 与 して頂 き ま した 東 北 大 学 医 学
部 の 芦 野 有 悟 先 生 に深 謝 致 します 。
文
1)BERGEY'S
ヽ
/帥
献
AL OF Systematic Bacte● ology,
V o l u m e 2 . W i l l i a m & W i n d n s , u s A . , 1 9 8 4 , 18“
-1449
j励 症 とM
2)豊 田丈 夫 ,青 柳 昭雄 ,斉 藤 肇 ,:Mα ッ
Jれ
r ″ε レ 症 結核 1 9 9 3 ; 6 8 ; 6 3 - 6 9 .
`滋
3)斎 藤 肇,村 上和保,石 井則久,他 :「
24時間風 呂」か
j″ COmplexの
らの iクcο
ι
α
Cr″′
″α
ッ
検出.結 核.2000;
“
75:19-25
4)佐
藤 明 正 ,穴 田勝 進 ,松 尾 秀 輝 ,他 lプ タ抗 酸 菌 症 を
ひ き起 こす ννcο
bα確 ″′ aッj“ ―
Mれ ′
rac′
′
ι
滋 ″の 感 染
“
“
源 .結 核 _1987:62:61-66
5)Van Soolngen D,Bauer J,Ritacco V,et al.:IS12イ
5 restnc―
tion iagment length nichl polymorphism typing ofル ″cο‐
″ isolates:proposal for standardization.J
bαcただ′″ αッ′
“
Clh Microbiol.1998;36:3051-3054
6)Guerrero C,Bernasconi C,Burki D,ct al.:A novel insertion
element from iィンCοらαεセrt“ αッ:“
″,IS12イ5,is a specinc
“
target for analysis of stram relatedness I Clin Microbiol.
桑 原 克 弘,渡 辺
5を 用 い た
靖,和 田光 一,他 :IS12イ
″症 の 臨 床 病 型 と多 ク ロー ン性 感
肺 ″r οιαε″″ ″ αッJ “
“
染 の 関連 に つ い て の 分 子 疫 学 的検 討 結 核 2 0 0 4 ; 7 9 :
39-46
″′″
桑 原 克 弘 ,渡 辺 靖 ,和 田 光 ― ,他 :肺 νァοらαC′
“
αν′
″″症 の 家 族 内 発 症 例 に 対 す る ISf2イ
5を プ ロー プ と
した分 子 疫 学 的検 討 _結 核 2004;79:519-523
Bauer J,Bengard A:Stability of lnsertion Sequence IS′
2イ5,
a Marker for Differentiation ofcο
lの
bacた万″ ανJ“
れ
“
Strains.J of Clinical Microbiology 1999;37:442-444
P e s t e Cl a‐r o n M , A r b e i r R D : C h a r a c t e d z a t i o n o f I S f 2 4 5 f o r
straln typing ″
o fc ル
αε″ガ
αッ: ン . J C l i n M i c r o b i o l
O夕
“
““
1998:36:1859-1863
de Viedma GD,Rodguez AN,Andres S,et al.:CharacteHza―
tion of clonal complexity in tuberculosis by mycobacterlal
vanable―
number tandem repcat
interspersed repetitive unit―
typing J Clin Microbiol.2005:43:5660-5664
‐
森 山 誠 , 小 川 賢 二 , 西 森 敬 , 他 : 臨 床 由 来 りc ο
j“
“
bac″′
れ ανJι
物 ￨こお け る Vttiable Numbers of Tandenl
R e p e a t s 型別 解 析 法 の 有 用 性 の 検 討
結核 2006;81:
559-566
Bauer 」, Bengard A, 1ひ emer K, ct al.:Useftllness Of
Spoligotyping To DiscHminate IS6ffθ Low‐Copy‐Number
結核 第 82巻 第 10号 2007年 10月
7イθ
わsis Complex Strains Cultured in
均 CοbaCただ れ ′ら
“ “ `ra“
DenFnark. Joumal of Clinical Microbiology 1999 ; 37 :
一一―――――
Original Article―
―
VARIABLE NUⅣ
2602-2606
COMPARISON OF USEFULNESS BEIWEEN
IBERS OF TANDEM REPEATS(VNTR)ANALYSIS AND
RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM (RFLP)
Иycθ Bz4CTER13MAylsu
IN THE GENOTYPING OFノ
lYuko KAZUMI,lTadashi UDAGAWA,lShin」
i ⅣLttDA,:Yoshirou MURASE,
llsamu SUGAWARA,2MaSa0 0KUMURA,3Yuka AZUMA,4MiekO GOTO,
and5NoHko TSUNEMATSU
Abstract[0● CCtiVes]Companson of usefuiness of 5ISf2イ
″ genotyping.
RFLP and VNTR inル 4 ανJ“
[Matenals and methods]Thity―
SiX Cases(55 strains)frOm
[Discussion]As there is a possibility of polyclonal infection
、
vith 雄、
αν′″ and nllxed infection with other species, the
“
single clonal infection should bc conirlned flrst by VNTR.
sputum and BALF and t、 vclve cases(29 strains)iSOlated from
Whcn single colony was obtained,VNTR and RFLP were
blood of HIV― infected patients were used.VblTR and RFLP
η.Furthennore,strains
perforlncd for genctyping ofル 生αッル′
using ISf245 were perfortncd.
with less bands by RFLP should be carefuny judged in te
[Result]Multiplc samples wcrc taken from 16 patients
and 52 clinical isolates were used for VNTR and RFLP for
compaHson(1)｀
NTR and RFLP results wcre identical in 12
of both NR and RFLP. It is reconlmended that the
speciinens should be collected from each patient several
tllnes.
out of 16 cases whose samples were collected several mes.(2)
Eight isolates were obtained froln one patient ln this eight
νj“
″ p01yclonal infection
isolates,there were the cases of M_α
ヶεοらαεκ滋 ″ αッル ,Variable Numbers of
“
T a n d e m R e p e a t s ( V N m ) , R e s 磁c ●o n F r a g m e n t L e n g t h P o l y ‐
and of mixed infection wi■lルこれ′ εαル麟″.VllTR Pattems
“
wcre two types and RFLP were 5 kinds of different h this
morphism(RFLP),Polyclonal
case(3)VNTR panems Ofsix isolates from one HIV‐
infected
Key words:ル
lResearch lnstitute of Tuberculosis,Japan Anti‐Tuberculosis
pattnt were idenical,butthere were three vanations in RFLP
Association(JATA),2Respiratory Medicine,and 3MediCal
Pattems.
r′
ι′r―
■ ere were threc cases of mixcd infections with逮 、
Laboratory, Fukuitti HOSpital, JATA, 4Department of
lnfection Control and Prevention, The University of Tokyo
′
″rraε
α′
θ,and six stralns PolyC10nal infection
Hospital,5Department of Clinical Laboratory,Tokyo Mctro‐
ειοsls or nヽ
`′
`JJtr′
ofル生αッ ″ (7.1%)in 84 isolates.These 6 clinical isolatespolitan Otsuka General Hospital
`“
were deHved from sputum or BALF(5 strains)and IIV―
infectcd blood(one strain).
Correspondence to:Yuko Kazumi,「
FB hfonnation Division
Epidemiology&Genetic ldendicadon),MyCO‐
V b l T R p a t t e m s w e r e s i m i l a r i n f o u r p a r s ( 9 s t t a l n s ) w h(MoleCular
o
〕
r‐
Research lnstitute of Tuし
did not contact closely, but they were distinguished clearly
bactenum Reference Center,恥
related
by RFLP.Scventeen strains had three or less ISf2イ 5‐
culosis, JATA, 3-1-24, Matsuyalna, Kiyose‐
bands in RFLP analyses of 89 strains.
204-8533 Japan.(E―mail:kazumiOjata.Orjp)
shi, Tokyo