トランスクリ プトーム解析に基づくマウス体内時計出力機構の解明

人間科学研究 Vo1.18,Supplement(2005)
博±論文要旨
トランスクリプトーム解析に基づくマウス体内時計出力機構の解明
Identification ofCircadian C1ock OutputMechanismBased on
TranscriptomeAna1ysis inMouse
南陽一(Minami,Yoichi)
指導:柴田 重信教授
序論
線溶系活性の変化等がいわれる。実際ヒトの線溶系の活性
生命現象には様々な周期性が観察され、1日を基準とし
には日内変動が知られている。発現解析及びプロモータ解
てそれより短い周期のものをウルトラディアンリズム、長
析から肋ノー!が時計制御下遺伝子だとする報告がされた
い周期のものをインフラディアンリズム、1日周期のもの
(Maemura θf∂五, 2000,Journa1of Biologica1
を日周リズムと呼ぶ。もっとも研究されているのは日周リ
Chemistry)。肋〃が体内時計に転写レベルで制御される
ズムで、外界からの時刻情報に依存しない内在一1生の日周リ
ために体内時計が標的生理機構の振動を作り出していると
ズムを概日リズム、概日リズムを駆動する機構を体内時計
いう考えである。このような体内時計の振動を特定の生理
という。体内時計の中枢は視交叉上核(SCN)と呼ばれる
機構に伝える役割を持つ遺伝子を、本稿では出力遺伝子
神経核に存在するが、分子レベルで体内時計を構成する時
(out−put gene)と定義した。
計遺伝子はSCNのみならず肝臓や心臓など末梢組織でも
本章では生体内で月∂ノー1が時計遺伝子の制御下に振動す
振動し、さらにRat−IやNIH/3T3といった株化細胞でも振
るか確認した。月∂ノー1が時計制御下遺伝子ならば時計遺伝
動する。時計遺伝子はE−box(CACGTG)を介した転写調
子の振動が失われた場合に肋〃の振動も消失すると考え、
節(促進性のBMALL CLOCK,抑制性のPERl−2,CRY1−
2,DECl−2)を中心に、REV−ERB/ROR応答領域(RRE;
αoo火遺伝子の点突然変異により時言十遺伝子の発現リズ
ムが平坦化するαoo火マウスにおける肋〃発現を検討し
[A/TlAlA/T1nT[A/G1GGTCA)を介した調節(促進性の
た。また肋ノー1遺伝子の発現位相が時計遺伝子発現に依存
RORα,抑制一性のREV−ERBα)、DBP応答領域(D−box;
して変位するか、末梢組織の時計遺伝子の発現位相を変位
TTA[C/TlGT^)を介した調節(促進性のDBP,抑制性の
させる制限給餌法(継続的に一日の一定時刻のみ餌を与え
E4BP4)によって、転写制御に基づく動的で複雑なネット
る)を行い、遺伝子発現パターンを検討した。
ワーク構造を成す。時計遺伝子でなぐとも時計遺伝子の結
(結果と考察)明暗条件下(明期、暗期とも12時間)で6
合領域をもつ遺伝子があり、これを蒔計制御下遺伝子
時間ごとに4点マウス心臓を採取してRT−PCR法による発
(c1ock contro11ed gene)と呼ぶ。本稿では、末梢組織に
現解析を試みた。野生型では、既韻どおり時計遺伝子発現、
おける時計制御下遺伝子の解明を試みた研究を展開する。
肋ノー!遺伝子発現に周期性が観察された。.αoo火マウスで
前半では、線溶系の概日リズムを扱い、体内時計が線溶系
は時計遺伝子の発現振動が減弱・消失し、肋〃遺伝子の
を制御する機構に関して検討した。後半では、DNAチップ
発現振動も消失した。光の影響を除くため恒常暗条件下で
を使ったトランスクリプトーム解析を行い、白色脂肪組織
も実験を行い、同様の結果を得た。次いで通常夜間に餌を
での発現振動を示す遺伝子(振動遺伝子,CyCling gene)
とるマウスに、日中の固定した4時間(ZeitgeberTime
の包括的取得を試みた。また、振動遺伝子が時計によって
5−9;ZeitgeberTime12が光のオンセット)のみ餌を提示
直接制御されているか、ゲノムワイドな時計遺伝子結合領
するスケジュールを繰り返す制限給餌法を試みた。野生型
域の探索と検証を行った。
では給餌時刻に依存して時計遺伝子発現位相が変化し、
肋ノー!遺伝子発現も同様に位相変位した。以上から肋ノー1が
第一章 出カ遺伝子としての胎〃
時計制御下遺伝子である可能性が支持された。肋ノー!が時
(序)線溶系は血管を閉塞し血栓症へと導くフィブリンを
計制御下に線溶系の振動を生み出す(出力遺伝子として機
溶解する機構である。プラスミノゲンを活性化してフィブ
能する)ことに加え、制限給餌法により遺伝子発現位相を
リンを溶解するプラスミンにするのが組織型プラスミノゲ
変えられたことは、食事時刻の変更という人為的な操作で
ンアクチベータ(tPA)であり、プラスミノゲンアクチベー
標的生理機構を任意の「時刻」に調節できることを意味し、
タインヒビター1(PAI−1)はtPAを不活化することで活
適切な時刻に適切な施療を目指す時間薬理学的観点から重
性を抑制する。
要な知見だった。
循環器系疾患には発症しやすい時刻があり、原因として
αoo火マウスでも制限給餌法を試みたところ、心臓の時
一g3一
人間科学研究 Vo1.18,Supp1ement(2005)
計遺伝子発現に給餌時刻に依存したリズムが形成された。
プの結果と類似していたのでDNAチップの結果が妥当だ
これは制限給餌性リズム形成にαoo火遺伝子が関与しな
と結論した。今回の時系列を追ったトランスクリプトーム
いことを示した初の知見であった。CLOCKが機能しなく
解析は、白色脂肪組織が動的な組織であることを再提示と、
ても時計遺伝子の振動が生み出された理由としては
NPAS2による代償作用が考えられた。NPAS2はSCN以外
従来の定点の遺伝子発現プロファイルを補完するデータを
供する意義があった。
の部位で発現振動し、制限給餌性リズムのようなSCN非依
得られた振動遺伝子に対する時計遺伝子結合領域の探索
存性リズム形成に関与する可能性がある(Minamiθ〆∂1,
を行った。公開されているゲノム情報から、マウスの振動
FEBS Lett,2002)。
遺伝子の1Okb上流を含む遺伝子配列及びヒトでの相同遺
伝子の10kb上流を含む遺伝子配列を取得し、比較から進化
第二章 白色脂肪組織における出カ遺伝子の包括的探索
的保存領域を抽出した。得られた領域に対し時計遺伝子に
(序)ヒトゲノム計画など種々の生物のゲノム解読計画が
よる制御配列(E−box,D−box,RRE)の存在の有無を検
進展した結果、全遺伝子を対象とした包括的研究が可能に
索した。この結果、95遺伝子にE−box該当配列、27遺伝子
なった。この代表的研究手法に転写単位でおきる現象を全
にD−box該当配列、33遺伝子にRRE該当配列を見出した。
て捉えようというトランスクリプトーム解析がある。体内
この中には細胞外マトリクス(ECM)リモデリングに関与
時計は転写調節を基本としてある状態を繰り返す系であり、
する因子(ECMを構成するCo14a1(RRE)、ECM分解酵
トランスクリプトーム解析に好適である。すでにSCN、肝
素のMMPを抑制するTimp3(D−box))、細胞周期に関与
臓や心臓など様々な組織でトランスクリプトーム解析によ
する因子(細胞周期の調節を担うρ2κ抄ノ(RRE)、〃6θ1
る振動遺伝子の抽出が試みられてきた。驚くべきことに時
(D−box))が含まれたので、これらが機能するか検証した。
計遺伝子など一部の遺伝子を除き振動遺伝子の多くが臓器
SV40basicpromoterで駆動される改変型ホタルルシ
ごとで異なり、このことは末梢臓器の時計がそれぞれ特有
フェラーゼの上流に該当配列を3回タンデムにつないだコ
の生理機構を制御していることを示唆している。
ンストラクトを作成し、NIH/3T3細胞を用いたtransient
本章では、白色脂肪組織における出力遺伝子の包括的取
transfectionアッセイ、また時計遺伝子が直接に結合する
得を目指した試みを行った。まず白色脂肪組織におけるト
ことが合成タンパク質を用いたe1ectromobi1ity shift as−
ランスクリプトーム解析を行い、振動遺伝子を同定した。
Say法によってこれらの該当配列が機能することが確認さ.
次いで公開されているマウスゲノム配列を利用して、DNA
れた。さらに、SV40basic promoterによって駆動される
チップで同定された振動遺伝子が機能する時計遺伝子結合
改変型ホタルルシフェラーゼの上流に該当配列を3回タン
領域をもつか検討した。
デムにつないだコンストラクトをRat−1細胞に導入して外
(結果と考察)マウス月θ〃プロモータを改変型ホタルル
日振動を惹起させ、生物発光をリアルタイムに長期問(4
シフェラーゼにつないだ遺伝子(ρθ〃一dLuc)を導入し
日間以上)観察する刀ガ伽o transcription dynamicsの
’た遺伝子導入ラットを用い、発光の経時的観察を行った。
アッセイによっても確認された。これら生理機構のキー
結果、白色脂肪組織で概日振動が観られたヒとから、白色
ファクターが時計遺伝子の直接の制御下にあることは、末
脂肪組織に時計機構が内在することを確認した。
梢組織の体内時計が、転写制御を介し特定の生理構構を調
次いでマウス(C57B1/6)を用い、明暗条件下及び恒常暗
節している例だと思われた。また、時計機構が概日振動を
条件下で4時間おき12点、白色脂肪組織を採取してtota1
惹起させる標的の生理機構に対し複数の介在点を持つこと
RNAを精製し、DNAチップ解析を行った。次いでコサイ
が示唆されたことは、標的の振動を確実なものとする系の
ンフィルターにかけ、明暗条件、恒暗条件ともに有意に発
頑強さを保持するために重要なものと解釈された。
現振動する遺伝子を抽出した。この結果、202遺伝子(206
プローブ)が振動することを見出した(振動遺伝子数は用
いた統計処理法に依存する)。振動遺伝子の発現ピーク時間
は24時間にわたり分布していた。振動遺伝子には、白色脂
肪組織から分泌される生理活性物質として知られる肋〃
や、白色脂肪組織特異的に発現することが知られるホルモ
ン感受性リパーゼなどが含まれていた。階層的クラスタリ
ング解析から主要5クラスターを見出した。各クラスター
から3遺伝子ずっを抽出して定量的PCR法による発現解
析を試みた結果、発現のピーク時間、振幅ともにDNAチッ
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