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植物医科学応用実験Ⅱ
植物ウイルス病の診断
電子顕微鏡観察による診断と血清学的診断技術について
Ⅰ．植物ウイルス病診断総論
１． 植物ウイルス病診断の手順
植物ウイルス病診断は、まず、感染植物の病徴観察を行いその症状からウイルス病で
あるかどうかを推定する。ウイルス病の疑いがあれば、各種の検定植物に対する汁液接
種検定を行うとともに、病植物組織片をダイレクトネガティブ染色法による電子顕微鏡
観察を行う。宿主植物の病徴、ウイルス粒子の形状（ひも状、球状など）、各種検定植
物に対する反応から、病原ウイルスが推定できれば、次に血清診断や遺伝子診断などの
簡易診断法を用いる。
（１）病徴観察（1 年生、2 年生前期実習参照）
植物ウイルス病に特徴的な病徴は以下のとおりである。
○モザイク Mosaic
葉のまだら模様。園芸植物には斑入り植物があり混同
しやすい。また、まだら模様が不鮮明な場合にはモッ
トル Mottle と呼ぶこともある。
○黄化 Yellows
葉の黄化、退緑症状。古くなった葉の黄化と混同しやすい。
図１ ラインパターン
○葉巻 Leaf roll
葉が内向きに巻き込む症状。栄養障害やアブラムシの被害と混同しやすい。
○輪紋・ラインパターン Ring spot, Line-pattern （図 1）
葉にリング状の斑紋や斑紋がつながった文様がでる。
○葉脈透過・葉脈緑帯 Vein clearing, Vein banding
葉脈が透けて見える。逆に葉脈に沿って濃い緑色の帯ができる。
○エソ症状 Necrosis
葉、茎、花弁に壊死した部分が全体的、または部分的に出現する。菌類病や細菌病に
よる症状と類似することがある。
○ブレーキング Color braking
花弁に現れるまだら模様。チューリップなどでは斑入り品種と混同しないように注意
が必要である。
1
○局部病斑 Local lesion（図 2）
検定植物に汁液接種した時に接種葉に現れる斑点。
周囲の葉の色より薄い退緑斑点 Chlorotic spot、エソ
斑点 Necrotic spot などがある。斑点の大きさも様々
で、針で突いたような小さなエソ斑点や直径数ｍｍに
及ぶ大きな退緑斑点や輪紋が出る場合もある。
図 2局部病斑
（２）汁液接種検定（1 年生実習）
病植物組織片に 0.1M リン酸緩衝液（還元剤などを添加することも多い）を少量加え
て、乳鉢で良く磨砕した汁液を、あらかじめカーボランダムを振りかけた検定植物の葉
に綿棒などで軽くこすりつけて接種する。
緩衝液や乳鉢は氷冷して使用することが望ましい。検定植物は、キノア、アカザ、各
種のタバコ属の植物など数種類の植物各 2，3 鉢を用いる。接種後は直ちに接種葉を水
洗し、汁液とカーボランダムを洗い落とすことが重要である。
果樹類の汁液接種の磨砕液には、2％ニコチン水溶液が良く用いられる。
通常、早ければ 3 日後、遅くとも 2 週間程度で局部病斑が出現する。その後、全身症状
が現れる。
なお、汁液伝染しないウイルスも多く存在するため、汁液接種でウイルスが検出され
ないことも多い。
（３）電子顕微鏡観察（今期実習対象）
今期に実習する技術である。電子顕微鏡には２種類の原理が異なる機種がある。透過
型（TEM）と走査型（SEM）である。
ウイルス粒子を観察するには透過型電子顕微鏡を用いる。透過型電子顕微鏡は、観察
試料に電子線を照射し、その透過率の差によりできた像を電子レンズの磁場により拡大
し、観察する顕微鏡である。TEM によるウイルス粒子の観察方法は次の 2 種類の方法
がある。実習では DN 法による観察を行う。
① ダイレクトネガティブ染色法（DN 法）
最も普通に用いられる染色液は、２％リンタ
ングステン酸（PTA）水溶液である。ウイルス
粒子や生体高分子は電子線の透過性が良いた
め、試料周辺に電子線が透過しにくい PTA や
酢酸ウラニルなどの金属原子（染色剤）が存在
することにより、試料が白い陰影像として観察
2
図 3 PVY 電顕写真
される。ひも状、棹状ウイルスのほとんどはこの染色液で観察可能である。た
だし、この染色液では観察できないウイルスがあり、その際には２％酢酸ウラ
ニル水溶液を用いると良い。
手技は簡単で、染色液と病植
物汁液が混ざった溶液を、あ
らかじめ準備したマイクログ
リッドに付着させるだけで観
察できる。（dip 法）
図 4 グ リッ ド
植物感染組織からウイルス粒子を検出することができるため、ウイルス病の診
断に多用される。しかし植物組織内のウイルス濃度の低い果樹ウイルスや、小
型球状ウイルスはこの方法では観察できないことが多い。このような場合には、
ウイルスを部分純化した標品を観察する。ウイルスの純化はそれぞれのウイル
スで工夫する必要がある。
② 超薄切片法
植物細胞内に存在するウイルス粒子を観察
する方法である。この方法は、DN 法では得ら
れない豊富な情報が得られる。例えば、ウイル
ス粒子の局在部位（核内か細胞質内か）、細胞
小器官のウイルスによる変性（葉緑体異常な
ど）、細胞内出現する封入体の検出（ポチウイ
ルス属に認められる風車状封入体など）が可能
である。しかし、観察用の試料調整として、組
織の固定、樹脂包埋、超薄切片作成などが必要
で、数日を要し、かつ、熟練した技術が必要で
図 5 超薄切片法電顕写真
ある。
③ 植物ウイルス粒子の形状（次頁図 6）
球状、ひも状、棒状など、ウイルスによって様々な形が存在する。
植物ウイルス病の診断・同定において、ウイルス粒子の形は重要な要素の一
つであり、ウイルス様症状が認められた場合、染色した感染植物の汁液をまず
電子顕微鏡によって検鏡する方法が用いられる。
3
図6
（４）血清学的診断技術（今期実習対象、および 3 年生後期）
ウイルス粒子の外被タンパク質などを抗原とする抗ウイルス抗体を用いる事で、植物
に特定のウイルスが感染しているか否かを診断する事が出来る。比較的簡便な方法が多
いが、特異的抗体が無いウイルスは検出することができない。
①ELISA 法（DAS-ELISA 法）
②ゲル内拡散法
③スライド凝集反応法
④イムノクロマト法
⑤免疫電顕
4
⑥ウエスタンブロッティング
電気泳動により分子量ごとに分離したタンパク質をニトロセルロース膜や
PVDF 膜に転写し、特定のタンパク質を抗原とする抗体で処理することで、そ
のタンパク質の存在を検出する手法。ウイルス感染植物からタンパク質を抽出
し、主に抗ウイルス外被タンパク質抗体を用いて検出することで、特定のウイ
ルスの有無を調べられる。
⑦Dot Immunobinding Assay（DIBA）法
感染植物をすり潰し、その磨砕液中に含まれるウイルスをニトロセルロース
膜に吸着させて、抗ウイルス抗体、酵素標識抗体を順に反応させる方法。
⑧蛍光抗体法
抗体に FITC（fluorescein isothiocyanate）などの蛍光色素を化学的に結合さ
せた蛍光抗体を抗原と反応させ、標識に用いた蛍光色素を蛍光顕微鏡下で観察
する方法。間接法では、病原菌と特異的に反応する抗体を処理した後、抗原に
結合した抗体（ウサギ IgG）を蛍光色素で標識した抗ウサギ IgG 抗体で検出す
る。
（５）遺伝子診断技術（3 年生前期）
植物に感染したウイルスからウイルスゲノムを抽出し、標的核酸を PCR または
RT-PCR によって増幅させて解析を行う。専用の機材などを必要とするが、血清診断と
比較してより正確な結果を得られる。
①DNA シークエンシング
PCR により増幅した核酸の塩基配列を解析する方法。主にサンガー法の原理
を基としている。塩基配列を明らかにすることで、ウイルスをより詳細に特定
することができる。
②LAMP 法
4 種類のプライマーと鎖置換活性のある DNA 合成酵素を用いて、一定温度で
DNA の増幅を行う。増幅と同時に生成される副産物により、液の白濁、または
紫外光による発光を観察できるため、増幅の有無を視覚的に確認することが可
能。
5
Ⅱ．電子顕微鏡観察手技
１ .透 過 型 電 子 顕 微 鏡 TEM: transmission electron microscope
（１）使用するもの
●電子顕微鏡
HITACHI H-7650（東館地下一階 精密分析室）
●グリッド（メッシュ）
グリッドは、透過電子顕微鏡で試料を観察するときに用いる直
径約 3mm、厚さ 10
50µm の円形の金属網のことで、光学顕微鏡の
スライドグラスに相当する。本実習では、銅製のグリッドの片面に
コロジオン、フォルムバールなどのプラスチック支持膜を張り、補
強のためにカーボン蒸着したものを用いる。
図 7 グリ ッド
極めてデリケートで、少しの力で曲がってしまい、コロジオン膜が破れて使用出来な
くなる。取り扱いには十分注意すること。実験台の上に落とすと、回収不能になるため、
メッシュを取り扱う時は、実験台にキムワイプを敷いておくと、落としても回収できる。
（２）観察方法
●dip 法
①スライドグラスに染色液（1%PTA,pH6.5）を一滴（約 50µl）置き、 5mm 幅
程の短冊状に切り取った感染組織（ORSV,CymMV,BBWV,PVY）を浸しカミソリで刻
むようにして植物組織の汁液を染色液中に滲み出させ、これを試料液とする。
①-1
①-2
②
②ピンセットでグリッドの端をつまみ、支持膜側を
下にしてスライドグラス上の試料液に乗せる。
③グリッドをキムワイプに乗せ、余分な試料液を濾
紙で吸い取り、風乾する。
④ホルダーにセットし、観察する。
6
③-1
③-2
※グリッドを扱うピンセットは専用のものを使い、生物を扱うものと別にする。
※ピンセット、カミソリによるコンタミに注意する。
※グリッド作成は全員が行い、班で各ウイルスにつき１グリッド観察する。
●ウイルスの純化（精製）
ウイルス感染植物からウイルス粒子を純化
（精製）することでより詳しい解析を行うこと
ができる。ウイルス濃度が低い場合や球状ウイ
ルスの場合、純化を行うと電子顕微鏡で観察し
やすくなる。一般的には、化学的処理と分画遠
心法を組み合わせて、感染植物を摩砕した汁液
から、植物組織片、細胞内構造物の破片、宿主
タンパクや色素などを除いてウイルスを濃縮す
るが、ウイルスによって純化方法は異なる。
図 8 純 化 TNV
課題１
透過型電子顕微鏡で観察したウイルスの写真を添付せよ。観察されたウイルスについ
て、それぞれ形態的特徴をまとめて属を同定せよ。観察された粒子の形状やおよそのサ
イズを、文献などと照らし合わせて確認する。
２.走査型電子顕微鏡 SEM: scanning electron microscope
ウイルス以外の植物病の原因として、菌や微小昆虫などが
あげられる。これらは光学顕微鏡でも観察することが可能だ
が、より微細な表面構造を調べるために走査型電子顕微鏡を
用いることがある。
（１）使用するもの
走査電子顕微鏡 HITACHI S-3400N
図 9 Microsphaeraalphitoides 卓上走査電子顕微鏡 JEOL NeoScope JCM-5000
走査型電子顕微鏡は、観察試料に電子線を照射し、そこから反射してきた電子（また
は物質から生じた二次電子）によって得られる像を観察する顕微鏡である。
（２）観察方法
●固定・脱水・乾燥・電導処理
走査電子顕微鏡で観察する場合、高真空下に試料を置くため、水分を含む生の生物試
料では収縮・変形・組織の構造変化を防ぐために固定を行う必要がある。固定には、薬
7
品を用いる化学固定法と凍結による物理固定法がある。一般的に、グルタルアルデヒド
（タンパク質の架橋）や四酸化オスミウム（リン脂質への付加）などの固定剤による化
学固定法が用いられ、固定液に試料を浸漬して固定する。
固定後はエタノール脱水系列による脱水と、二酸化炭素による臨界点乾燥法または
t-ブチルアルコールによる凍結乾燥法で乾燥を行う。また、脱水乾燥した生物試料には
電導性がほとんどなく、照射電子によってチャージアップ（帯電）して二次電子像に画
像障害（露出オーバーと像の歪み）が生じるため、金属コーティング（蒸着）により試
料の電導処理を行う。
●低真空型走査顕微鏡（今回 SEM は全て低真空のものを使用する）
高真空下（＜1Pa）で反射電子と二次電子を検出して観察を行う一般的な走査電子顕
微鏡に比べ、低真空 SEM では低真空（∼270Pa）に設定することができ、反射電子を検
出して観察する。低真空
の試料室内では入射電子
や反射電子が残留ガスと
衝突してそれをイオン化
し、そのイオンによって
試料表面のチャージアッ
プ電荷が中和されるため、
試料が絶縁物である場合
でも金属コーティングせ
図 10 低 真空 型走 査電 顕構 造 ずに観察することが可能である。また、水分の蒸発が低減されるため、含水試料の観察
が可能である。これらの特徴から、低真空 SEM では生物試料を前処理なしで観察するこ
とができる。
病原菌の観察（SEM）
方法：①さび病の病斑部分、うどんこ病の閉子のう殻を形成している個所を 5mm
角に切り、カーボンテープを貼った試料台に置き、貼り付ける。試料台には
2∼3 片のサンプルを置く。
②試料台を SEM にセットし、低真空で観察する。
※高倍率で一部分に電子線を当て続けると組織が変形することがあるので、素早
く観察・撮影する。
課題２
走査型電子顕微鏡で観察したさび病菌、うどんこ病原菌の写真を添付し、形態的特徴
をまとめよ。形態的特徴から、各菌の属名を同定せよ。
8
アザミウマの観察（卓上 SEM）
方法：①アザミウマを実体顕微鏡下でカーボンテープを貼った試料台に置く。背中
側を上にしたものと背中側を下にしたものと 3 頭ずつ置く。
②卓上 SEM で観察する。頭部の刺毛の位置や数、触角の節数・形態などを観
察する。また、複眼や口器、足の形態などを観察する。
※高倍率で一部分に電子線を当て続けると組織が変形することがあるので、素早
く観察・撮影する。
課題３
①走査型電子顕微鏡で観察したアザミウマの分類
学的形質の写真を撮影して添付し、２種のアザミウ
マの違いを記述せよ。また、形態的特徴から A、B
がそれぞれ何アザミウマか同定せよ。
②日本の農作物で問題になっているアザミウマ類
の生態と防除について調べ、その概要を記述せよ。
図 11 ネ ギア ザミ ウマ 9
ササ類�さび病：�冬胞子堆、夏胞子、冬胞子�
ハギさび病：夏胞子、冬胞子、冬胞子堆�
エンジュさび病：冬胞子、冬胞子堆�
チャンチンさび病：!
夏胞子、夏胞子堆、冬胞子、冬胞子堆�
←�ヒペリカム（ビョウヤナギ等）さび病：夏胞子、夏胞子堆�
ナシ赤星病：!
��さび胞子、護膜細胞、!
��さび胞子堆�
ハマナスさび病：夏胞子、夏胞子堆、冬胞子、冬胞子堆�
Ａ． Cronartium
C. orientale ：
a．マツこぶ病（精子・さび胞子世代）
ｂ．さび胞子
ｃ．コナラ病葉上の冬胞子堆
ｄ：同 夏胞子
e：連結した冬胞子，発芽して生じた担子器
と担子胞子 〔金子 繁〕 ｄ
ｂ
ａ
ｅ
ｃ
Ｂ．Gymnosporangium
ａ
ｃ
ｂ
ｄ
ｅ
ｆ
G. aiaticum ：a．ナシ赤星病罹病葉裏面のさび（銹）胞子堆（しゅう（銹）子毛），ｂ：同 精子器断面，
ｃ：同 さび胞子堆断面，ｄ：さび胞子堆，e：ビャクシン上の冬胞子堆，ｆ：冬胞子 〔柿嶌 眞〕
Ｃ．Melampsora
ａ
ｂ
ｄ
ｅ
ｆ
ｃ
M. lalici-populina ：ａ．カラマツ針葉上のさび胞子堆断面，ｂ．さび胞子，ｃ．ポプラ病葉上の夏胞子堆，
ｄ．夏胞子，e．糸状体，ｆ．ポプラ病葉の表皮下に形成された冬胞子堆
〔金子 繁〕
Ｄ． Nyssopsora
ａ
ｂ
ｄ
ｃ
N. cedrelae：a．チャンチン上の冬胞子堆，ｂ．夏胞子，ｃ．冬胞子，ｄ．冬胞子表面の突起
Ⅱ.38 さび病菌類 （プシニア目）
〔柿嶌 眞〕
E． Phakopsora
ｃ
ｂ
ｅ
ｄ
ｆ
ａ
P. ampelopsidis ：a．アワブキ葉上の精子器・さび胞子堆，ｂ．角皮下に形成された精子器の断面，
ｃ．しゅう（銹）子腔状さび胞子堆断面，ｄ．ノブドウ上の夏胞子堆・冬胞子堆，e:糸状体に囲まれた夏胞子堆断面，
ｆ．表皮下に発達した冬胞子堆断面
〔小野義隆〕
F． Phragmidium
ａ
ｂ
ｄ
ｃ
G． Puccinia
ｂ
ｈ
ｄ
ｃ
ａ
ｅ
P. montivagum (acd)、
P.rosae-multiflorae (b)、
P.griseum (e)：
a．ハマナス病葉上の冬胞子堆，
b．さび胞子堆断面，c：夏胞子，
de：冬胞子
〔山岡裕一〕
ｉ
ｆ
ｅ
ｇ
H． Uromyces
ａ P. sessilis (a-d)，
P.tanaceti var.tanaceti (e-i)： a．ナルコユリ病葉上のさび胞子堆，
b．精子器断面，c．さび胞子堆断面，d．さび胞子，
e．キク上の夏胞子堆と冬胞子堆，
f．夏胞子堆断面，g．夏胞子，h．冬胞子堆断面，
i．冬胞子とその発芽（担子器と担子胞子）
〔柿嶌 眞〕
ｃ
ｄ
ｂ
ｅ
Uromyces viciae-fabae var.viciae-fabae ：
a．ソラマメ病葉上の夏胞子堆断面，ｂ．夏胞，ｃ．冬胞子堆，ｄｅ．冬胞子
〔柿嶌 眞〕
Ⅱ.38 さび病菌類 （プシニア目）（続）
付属糸
うどんこ病菌：属の類別ポイント
閉子嚢殻世代 ①
(1)
菌糸状
Erysiphe属 (Erysiphe節菌) 先端が規則的に
1∼数回又状分岐
Erysiphe属 (Microsphaera節菌) Podosphaera属
(Podosphaera節菌) Blumeria属
先端は規則的に1∼数
回又状に分岐
うどんこ病菌：属の類別ポイント
閉子嚢殻世代 ②
付属糸 (2)
一部2回または
３回又状分岐
Sawadaea属
針状、
基部は半丘状
Phyllactinia属
先端は渦巻き状
Erysiphe属
（Uncinula節菌）