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耐性菌を作らない
新たなMRSA感染治療法
小澤俊幸、森本訓行、鶴田大輔
大阪市立大学大学院医学研究科 皮膚病態学
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光線力学療法(PDT)
• PDTは光感受性物質に、ある特定の波長の光を照
射することにより、細胞内に活性酸素を発生させ、
選択的に腫瘍細胞を死滅させる治療法です。
• 現在、皮膚癌、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍などで臨床
応用されている。
• PDTは抗腫瘍作用の他に殺菌作用も有しており、
耐性菌を生じないとされている。
Photodynamic Therapy (PDT)
光
光感受性物質
取り込まれる
酸素
光感受性物質
活性酸素、1O2
細胞膜の破壊
DNA
DNAの破壊
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5-アミノレブリン酸 (5-ALA) のPDT
光
5-ALA
ポルフィリン代謝
酸素
PpⅨ
活性酸素、1O2
細胞膜の破壊
DNA
DNAの破壊
PpⅨ：プロトポルフィリンⅨ
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5-aminolevulinic acid (5-ALA)
Porphobilinogen
Hydroxymethylbilane
Uoporphyrinogen Ⅰ(UPⅠ)
Uoporphyrinogen Ⅲ (UPⅢ)
Coproporphyrinogen Ⅰ(CPⅠ)
Coproporphyrinogen Ⅲ (CPⅢ)
Heme D1
Protoporphyrinogen Ⅸ
Protoporphyrin Ⅸ (PpⅨ)
Protoheme Ⅸ (Heme B)
Heme C
Heme D
Heme O
5-アミノレブリン酸 (5-ALA) のPDT
光
5-ALA
ポルフィリン代謝
酸素
PpⅨ
活性酸素、1O2
細胞膜の破壊
DNA
DNAの破壊
PpⅨ：プロトポルフィリンⅨ
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5-アミノレブリン酸の特徴
代謝経路が100%解明されているアミノ酸
健康食品にも添加されている
アラグリオ®内用剤として2013年３月承認
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プロトポルフィリンⅨ (PpⅨ)の吸収スペクトル
410
青色４１０nm
635
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光線力学療法(PDT)
• PDTは光感受性物質に、ある特定の波長の光を照
射することにより、細胞内に活性酸素を発生させ、
選択的に腫瘍細胞を死滅させる治療法です。
• 現在、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌などで臨床
応用されている。
• PDTは抗腫瘍作用の他に殺菌作用も有しており、
耐性菌を生じないとされている。
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皮膚悪性腫瘍のPDT
ボーエン病
Dye laser photodynamic therapy for Bowen's disease in a patient with
epidermodysplasia verruciformis. Osaka City Med J. Ozawa et al.2012 Dec;58(2):77-
光線力学療法(PDT)
• PDTは光感受性物質に、ある特定の波長の光を照
射することにより、細胞内に活性酸素を発生させ、
選択的に腫瘍細胞を死滅させる治療法です。
• 現在、子宮頸癌、肺癌、脳腫瘍、皮膚癌などで臨床
応用されている。
• PDTは抗腫瘍作用の他に殺菌作用も有しており、
耐性菌を生じないとされている。
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全身熱傷などは感染のコン
トロールが出来なければ
致死的となる。
特に多剤耐性菌が問題
になる。
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院内感染対策サーベイランス JANIS
• 平成19年4月に施行された改正医療法により、すべての医療
機関において管理者の責任の下で院内感染対策のための
体制の確保が義務化
• 院内感染対策サーベイランス（JANIS）は、参加医療機関にお
ける院内感染の発生状況や、薬剤耐性菌の分離状況および
薬剤耐性菌による感染症の発生状況を調査し、我が国の院
内感染の概況を把握し医療現場への院内感染対策に有用
な情報の還元等を行うことを目的する。
http://www.nih-janis.jp/about/ より引用
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メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
MRSA
• 抗生物質メチシリンに対する薬剤耐性を獲得した黄
色ブドウ球菌
• 実際は他の多くの抗生物質に対して耐性を持つ
• 多剤耐性菌の代表
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目的
光感受性物質として5-アミノレブリン酸を、
光源として410 nmのLEDを用い、
MRSAに対するPDTの殺菌効果について
in vitro、in vivo において検討する。
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in vitro
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検証事項 (in vitro)
MRSAに対するPDTの条件
・殺菌効果の程度
・5-アミノレブリン酸の濃度
・照射出力
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MRSAに対するPDTの条件
方法
・ MRSA（ATCC 33591）を液体培地に入れ、37℃で24時間培養。
・ 培養したMRSAの菌量を108 CFU/mlに調整。
・ 5-アミノレブリン酸1〜50 mg/ml（0.1〜5 %）に希釈し菌液に添加。
・ 4時間後に青色LED(波長410 nm)を5, 20, 50 J/cm２で照射。
・ CFUを測定。
ALA濃度、照射出力を検討
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生菌数を測定
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MRSAに対するPDT
(5-ALA濃度、照射出力との関係)
5-ALA接触4時間
1×109
除菌率99.999 ％
1.00E+09
細菌数 (CFU/ml )
1.00E+08
1×108
1.00E+07
1×107
1.00E+06
1×106
1.00E+05
1×105
ALA 25mg/ml
1.00E+04
1×104
ALA 5mg/ml
ALA 2.5mg/ml
1.00E+03
1×103
ALA 0.5mg/ml
1.00E+02
1×102
1.00E+01
1×101
1.00E+00
0
0
10
20
30
40
照射出力 (J/cm2 )
50
60
n=3
MRSAに対するPDT (in vitro)
今回のMRSAに
臨床における悪性腫瘍に
対するALA-PDT(in vitro)
対するALA-PDT
ALA濃度
0.25 %
20 %
照射出
力
細胞毒
性
50 J/cm2
50〜150 J/cm2
なし
なし
in vitroで波長410 nmのALA-PDTは効果的
臨床応用へ向けin vivoで検証
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in vivo
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検証事項 (in vivo)
① MRSA感染皮膚潰瘍モデルの作成
② 5-ALAの投与経路
③ PDTのマウスMRSA感染皮膚潰瘍モデルへの効果
④ バンコマイシン投与との比較
⑤ 創部の菌量の比較
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① マウスMRSA感染皮膚潰瘍モデル
・ 成熟雄糖尿病マウス（C57BL/ksj db/db 8〜10週齢）。
・ 背部に直径6mmの全層皮膚欠損創を作成。
・ 創面に1×1010 CFUのMRSAを接菌。
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創の経過
正常潰瘍
MRSA感染モデル
Day 1
Day 4
Day 7
Day 10
Day 13
25
創面積縮小率（MRSA感染モデル）
140
正常潰瘍
創面積 (% of original size)
120
MRSA感染群
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
PDT後の日数
26
② 5-アミノレブリン酸の投与経路
LED
従来は塗布
MRSA
創面
毛細血管
5-ALAの局所投与
5-ALA
PpⅨ
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② 5-アミノレブリン酸の投与経路
LED
全身投与
MRSA
創面
毛細血管
5-ALAを腹腔内投与
5-ALA
PpⅨ
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腹腔内投与によるPpⅨの蓄積
MRSA塗布４８時間後、腹腔内に5-ALA 200 mg/Kgを投与し24時間後
ウッド灯を照射
創面塗抹標本の共焦点レーザー顕微鏡画像
(405 Diode, UV. Emission bandwidth : 620 nm – 650 nm).
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③ PDTの創傷治癒への影響
・マウスMRSA感染皮膚潰瘍モデル作成48時間
後、腹腔内にALA 50 mg/Kg、 200 mg/Kg投与。
・24時間後、創面に波長410 nmのLEDを10、50
J/cm2で照射。
・再度ALAを投与し、24時間後にLEDを照射。
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創の経過
正常潰瘍
MRSA感染モデル
PDT群
(5-ALA200mg/Kg
LED 50J/cm2)
Day 1
Day 4
Day 7
Day 10
Day 13
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創面積縮小率
5-ALA 200 mg/Kg腹腔内投与
140
LED未照射群
創面積(% of original size)
120
2
10 J/cm2照射群
100
2
50 J/cm2照射群
80
60
40
20
0
0
5
10
PDT後の日数
15
n=5
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創面積縮小率
5-ALA 200 mg/Kg腹腔内投与
140
MRSA感染群
120
創面積(% of original size)
正常潰瘍
LED未照射群
100
2
10 J/cm2照射群
2
50 J/cm2照射群
80
60
40
20
0
0
5
10
PDT後の日数
15
n=5
④ バンコマイシン (VCM) の効果
マウスMRSA感染皮膚潰瘍モデルに
VCM(110mg/Kg)を１日２回皮下注射。
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創の経過（VCM投与群との比較）
正常潰瘍
MRSA感染モデル
VCM投与群
PDT群
(5-ALA200mg/Kg
LED 50J/cm2)
Day 1
Day 4
Day 7
Day 10
Day3513
創面積縮小率（PDT vs VCM）
正常潰瘍
140
MRSA感染群
創面積 (% of original size)
120
PDT治療群
バンコマイシン治療群
100
80
60
40
20
0
0
5
10
PDT後の日数
15
n=5
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創部の菌量の比較
＊
1.00E+09
創部の菌量(CFU/cm2 )
1×109
1.00E+08
1×108
1.00E+07
1×107
1.00E+06
1.00E+05
1×106
1×105
＊P＜0.01
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まとめ
・5-ALAを用いたMRSAに対するPDTは充分な殺
菌効果があった。
・5-ALAを腹腔内投与し、青色410nmLEDを照射
するPDTは、MRSA感染皮膚潰瘍の創傷治癒を促
進させた。
・5-ALAを用いたPDTは、MRSAによる創部感染に
対して耐性菌を生じない、新たな治療法となる
可能性があると考える。
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今後の展望
・広範囲熱傷患者への感染成立前の予防的治療
・他菌種への応用
・他臓器への応用
・真菌への応用
39
ありがとうございました。
40