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アブラナ科植物の萎黄病菌に対す
る抵抗性の判定法
新潟大学 自然科学系（農学部）
教授 岡崎 桂一
1
研究の背景１
アブラナ科植物とは
アブラナ科祖先種
ゲノムの3倍加（130〜170万年前）
＊
2000万年前
アブラナ属祖先種
祖先種
シロイヌナズナ（n=5）
R. sativus; n=9
800万年前
Brassica rapa; n=10
B. oleracea; n=9
2
研究の背景２
萎黄病とは
❍萎黄病菌（Fusarium oxysporum）による土壌伝染性病害。
❍根から導管に感染し，葉の黄変，萎れ，枯死を引き起こす。
❍４つの分化型（f. sp. conglutinans, f. sp. rapae, f. sp. raphaniな
ど ）がある。
18℃
Type A
Type B
24℃
28℃
単因子優性遺伝子支配
量的遺伝子（QTL）支配
3
本技術の特徴・従来技術との比較
アブラナ科作物の生産現場で問題となってい
る萎黄病に対する抵抗性遺伝子を同定し， そ
の遺伝子から抵抗性を示す個体を選抜する分
子(DNA) マーカーを開発した。
本方法は、従来法の病原菌接種試験法に比
べ，大幅に労力と時間を節約できるほか，環境
の影響を受けず再現性のある結果が得られる。
また，本方法を用いると個体が抵抗性遺伝子を
ホモで持つか，ヘテロで持つかを判定できる点
もメリットである。
4
Ⅰ．Differential expression解析を用いた
ハクサイ萎黄病抵抗性遺伝子の同定
DI=0
無病徴
Hiseq-2000
DI=1
黄化
DI=2
枯死
播種14日後（非感染）
よりTotal RNAを抽出
近交系10系統
T04
T15
T17
T21
T23
T25
T13
T14
T22
T24
DI
0.00 ±0.00a (S )b
0.00 ±0.00 (S )
0.00 ±0.00 (S )
0.00 ±0.00 (S )
0.00 ±0.00 (S )
0.00 ±0.00 (S )
2.00 ±0.00 ( R )
1.86 ±0.14 ( R )
2.00 ±0.00 ( R )
2.00 ±0.00 ( R )
分析した系統を示す
5
結果１. 抵抗性･罹病性系統におけるNBSLRRモチーフをもつ遺伝子の発現解析
244遺伝子（NBS-LRRモチーフをもつ遺伝子数）
Tophat/cuffdiffによる発現比較
（十分な発現を示しているか？）
29遺伝子
215遺伝子
少なくとも一方で発現しているか？
転写量2倍以上で有意な差を示すか？
9遺伝子
YES
NO
20遺伝子
171遺伝子
44遺伝子
両系統で発現しているか？
152遺伝子
19遺伝子
2倍以上の発現の差を示すか？
42遺伝子
110遺伝子
6
結果２．近交系での選抜遺伝子のgenomic
PCRと接種試験
近交系
Size
T24
T22
T14
T04
罹病性
T21
T17
T25
T15
選抜遺伝子
T23
抵抗性
Bra008056
Bra022071
Bra012540
Bra008055
Bra012688
Bra012689
7
T24
T23
結果３．T24(罹病性)×T23(抵抗性)のF2分離集団に
おけるBra012688のジェノタイピングと接種試験
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
No.
R S S S S R R S R S R R R R R R R R S R S R R S
表現型
23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
R R S S R R S R R R R R S R R S R R S R S S R R
接種試験
8
結果４． 抵抗性候補遺伝子の構造と感受
性系統（T23）における欠失領域の推定
2
3
4
5
T23
T24
kb
T23
T24
1
Bra012689 Bra6
Bra012688
6
T23
T24
Bra3
T23
T24
T23
T24
T23
T24
1kb
Bra1 Bra2
2.0
1.0
0.5
0.1
9
Ⅱ.マップベースクローニング法による萎黄病
抵抗性候補遺伝子の同定
萎黄病抵抗性 萎黄病感受性
安寿（キャベツ）GC（ブロッコリー）
❐萎黄病抵抗性検定（F3検定）
抵抗性
感受性
個体数
❐罹病度指数（DI）
DI=0 DI=1 DI=2
無病徴 黄化 枯死
F2・３個体の罹病度
10
CB10030
BRMS226
Na12-B11
Ol13-F08
IGF2562d
BRAS014
KBrB027J
MD50
CB10121
KBrS012D
KBrB084F
KBrB089H
pW174
KBrS003O
BSA8
TCR05
pW166
BnGMS616
KBrH097K
ME2OD26
14.9
24.4
26.0
28.3
30.1
33.1
39.8
50.5
51.1
51.6
59.1
60.2
61.4
85.2
40.0
60.0
81.0
18.0
B. oleracea（第7染
16.0
色体）
14.0
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0
0.0
20.0
53.3
F6R6
CB10297
CB10528
F2R11
BRAS023
CB10299
BRMS005
KBrB086E
0.0
0.5
1.0
4.3
5.4
6.8
10.5
12.7
LOD値
結果１．
QTL解析
FocBo1
（萎黄病抵抗性遺伝子）
80.0
11
結果２． FocBo1遺伝子のファインマッピング
KBrS012
KBrB084
pW174
KBrB089
BoInd1
KBrS003
BoInd2
BoInd3
BoInd4
BoInd5
BoInd11
BoInd14
BoInd15
CB10634
BoInd16
Bo1259
KBrH059
FocBo1QTL領域
個体 No DI ±SE
AGF2645
AGF2836
AGF2766
AGF2293
AGF2647
AGF2649
AGF2651
AGF2537
AGF2850
AGF2283
AGF2909
AGF21008
AGF2995
AGF2190
AGF2853
AGF2947
AGF2654
0.0 ±0.0
0.0 ±0.0
0.6 ±0.2
0.6 ±0.3
0.5 ±0.4
0.4 ±0.3
0.0 ±0.0
0.1 ±0.1
2.0 ±0.0
2.0 ±0.0
2.0 ±0.0
0.8 ±0.2
0.4 ±0.2
2.0 ±0.0
1.9 ±0.1
1.9 ±0.1
0.4 ±0.2
FocBo1
遺伝子型
抵抗性ホモ
ヘテロ
罹病性ホモ
12
ハクサイ「Chiifu-401-42」
（Brassica DBより）
012687
012688
012689
012690
012692
012691
012693
012697
012696
012695
012694
012698
#26
#27
#25
#22
#23
#24
#19
#20
#21
カイラン（B. oleracea A12）
012699
#03
#04
#05
#06
#07
#08
#09
#10
#11
#12
#13
#14
#15
#16
#17
#18
#02
#01
結果３． FocBo1領域のBACクローンの単
離と候補遺伝子予測
BAC58クローンより
10 kb
13
結果４ 抵抗性系統「安寿」のFocBo1の単
離と配列比較
欠失
挿入
FocBｒ1
Bra012688 (T23)
B. rapa（T23)
Bra012689(T23)
FocBo1
Anju
A
GC
A
A12
#25-gene
表：FocBo1とFocBr1(Bra012688)の構造比較
E1
Anju
20
I1
E2
511 441
I2
E3
I3
90 1084 92
E4
I4
E5
I5
E6
I6
E7
I7
E8
309 138 480 510 483 248 1185 101
93
GC
20 490 442 89 1084 92 309 138 480 510 482 247 1179
Bra012688 83 508 441 79 1084 92 309 138 480 494 483 248 1194 106
・Eと Iは，それぞれエキソンとイントロンを表し，表中の数字は塩基数を示す。
93
14
Ⅲ．マーカー利用選抜：選抜マーカーのプライマーポジション
Anju FocBo1
Bra012689オレラセア偽遺伝子
MTK-A
MTK-0
#26
#27
#25
#22
#23
#24
#19
#20
#21
#03
#04
#05
#06
#07
#08
#09
#10
#11
#12
#13
#14
#15
#16
#17
#18
#02
#01
カイラン（B. oleracea A12） BAC58クローン
10 kb
MTK-1
B. rapa（T23) FocBｒ1
Bra012688 (T23)
Bra012689(T23)
Bra012688m
15
結果１.B. oleracea選抜用マーカーのバンド
空欄はＰＣＲで増
パターン
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
幅が見られなかっ
（Anju）
(a) 近交系（ホモ
系統）
MTK-A
MTK-0
MTK-1
（GC） （NN11） （NN1）
たことを示す
（A)
（A)
（A)
526bp
487bp
（G)
（G)
（A)
（G)
506bp
484bp
Group A Group B Group C Group D Group E Group F
Ⅰ×Ⅰ Ⅰ×Ⅱ Ⅰ×Ⅳ Ⅱ×Ⅱ Ⅱ×Ⅲ Ⅲ×Ⅳ
Ⅰ×Ⅲ
Ⅱ×Ⅳ
(b) 市販品種
MTK-A
（A)
（A)
MTK-0
MTK-1
（A)
（A)
（A)
（A)
（G)
（G)
（G)
（G)
（G)
（A)
（A)
（G)
（A)
（G)
（G)
（A)
（A)
16
結果２. 市販品種の選抜マーカー分析および接
種試験
(GroupA)
(GroupB)
遺伝子型
Ｆ１品種
ホモヘ 表現
MTK- MTK MTK- テロ判 型
A
-0
1
定
(GroupA)
彩風
A
彩ひかり （ＮＤ）
YR楽山
A
夢ごろも
A
若峰
A
涼音
A
あさしお
A
星岬
A
いろどり
（ＮＤ）
マイペース A
YR天空
A
彩里
A
Ｆ１品種
(GroupC)
ホモ
ヘテ
MTK- MTK MTK- ロ判 表現
A
-0
1 定
型
遺伝子型
(GroupC)
(GroupB)
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
Rホモ，H
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
Ｆ１品種
ホモ
ヘテ
MTK- MTK MTK ロ判 表現
A
-0 -1 定 型
遺伝子型
春のかほり （ＮＤ） AG
AG
YR新風
A
YRSE
AG
A
AG
A
YR青春二号
YR春空
（ＮＤ） AG
AG
夢舞台
A
浜岬
（ＮＤ） AG
アーリーボール （ＮＤ） AG
麗峰1号
（ＮＤ） AG
YR清美
（ＮＤ） AG
みさき
（ＮＤ） AG
YR金春5号 （ＮＤ） AG
みくに
（ＮＤ） AG
沢ゆたか （ＮＤ） AG
AG
シャスター
A
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
AG
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
グリーンビュー
ティー
AG
H
R
A
AG
おきな
YRしぶき
好菜堂
祝園
もとき
錦秋強力
152
秋空
恋岬
YR夏晴
A
A
（ＮＤ）
（ＮＤ）
（ＮＤ）
A
A
A
A
A
AG
AG
AG
AG
AG
H
H
H
H
H
R
R
R
R
R
（ＮＤ）
（ＮＤ）
（ＮＤ）
（ＮＤ）
A
A
A
A
AG
AG
AG
AG
H
H
H
H
R
R
R
R
17
市販品種の選抜マーカー分析および接種試験
（つづき）
(GroupE)
(GroupD)
Ｆ１品種
MTKホモヘテ 表現
MTK-A 0 MTK-1 ロ判定 型
(GroupD)
味春
初秋
輝岬
金系201号
Non
Non
（ＮＤ）
Non
Non
YR春系305号
スピードボール２号 Non
デリシャス
（ＮＤ）
Non
シティー
藍春ゴールド
（ＮＤ）
YRデライトボール
（ＮＤ）
Non
フォレスト
Non
スピードドーム
Non
キャッスル
Non
緑嶺
Ｆ１品種
MT MTK ホモヘテロ
MTK-A K-0 -1 判定
表現
型
(GroupE)
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
Sホモ
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
ジャンヌ
冬穫B号
ハイツSP
AG
AG
AG
Sホモ
Sホモ
Sホモ
S
S
S
さつき女王 Non Del AG
早生秋宝 （ＮＤ） Del AG
Sホモ
Sホモ
S
S
Non
Non
（ＮＤ）
G
G
G
(GroupF)
18
結果３.萎黄病菌分化型rapaeとconglutinans
の接種試験
rapae
‘240326’
〈キャベツ〉
追風
-
将軍
-
YR金春
5号
〈ブロッコリー〉
緑嶺
rapae
‘240326’
conglutinans
‘cong1-1’ FocBo1
〈コマツナ〉
極楽天
黒みすぎ
+
〈チンゲンサイ〉
-
〈タアサイ〉
長陽
緑彩1号
conglutinans
‘cong1-1’ FocBo1
+
+
19
結果４.コマツナ市販品種における表現型・遺伝
子型の比較
conglutinans
平均罹病度指数
rapae
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
平均罹病度指数 0 : 無病徴, 1 : 矮化・黄化, 2 : 枯死
FocBr1 ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − −
20
平均罹病度指数
結果５.ハクサイ・チンゲンサイ・カブにおける表現
conglutinans
型・遺伝子型の比較
rapae
FocBr1
ハクサイ
+ + + + + + + + + + + + + + + - - + + + + + + + + - -
平均罹病度指数 0 : 無病徴, 1 : 矮化・黄化, 2 : 枯死
21
平均罹病度指数
結果６.コマツナ近交系における表現型・遺伝子型
f. sp. conglutinans 接種
系統番号
FocBr1
0.無病徴
-
1.葉巻,矮化
2.黄化,落葉
-
-
-
3.枯死
22
想定される用途と実用化に向けた課題
● 煩雑で環境の影響を受ける接種試験をせずとも，抵抗性遺伝子
の有無を判定でき，育種の効率化を図れる。
● 萎黄病罹病性遺伝子を排除した抵抗性遺伝子のみを含む育種
母集団を育成できる。
●マーカー利用選抜が可能かどうかは，主に市販品種を用いて
実施しているが，市販品種の親系統を用いて実施する必要が
ある。
●各種苗メーカーで実用化する場合には，所有する親系統の抵抗
性遺伝子の有無をマーカー利用で判定すると同時に，1回は接
種試験を行う必要がある。
23
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称
：萎黄病菌抵抗性を有するポリヌクレオチド、及び
その利用、並びにアブラナ科植物の萎黄病菌に
対する抵抗性の判定方法
• 出願番号
• 出願人
• 発明者
：特願2013-213332
：国立大学法人 新潟大学
： 岡崎桂一，清水元樹，藤本 龍，川邊
隆大，
蒲子婧，加治 誠，長岡 朝彦
• 問い合わせ先 ：
新潟大学 産学地域連携推進機構
産学地域連携推進センター
ＴＥＬ
０２５－２６２ － ７５５４
ＦＡＸ
０２５－２６２ － ７５１３
e-mail [email protected]
24